栝楼性别转化的RAPD-SCAR标记研究
【摘要】：
栝楼(Trichosanthes kirilowii Maxim)是葫芦科栝楼属的一种药食两用植物,多年生草质藤本。栝楼种植历史悠久,栝楼根、果皮、果实均可入药。随着近年栝楼籽休闲食品的开发,栝楼的根与果实的主要用途发生很大变化,市场价格相差悬殊,从综合效益考虑,有效控制雌、雄株比例在生产上是非常必要的。栝楼雌、雄异株,在栝楼未开花前从形态上很难辨别雌雄株,所以,所以在苗期利用分子生物学的方法鉴别未成熟栝楼的性别,可为栝楼生产上合理的雌、雄性植株田间配置以及育种工作中的早期选择等提供科学依据,对栝楼产业持续、快速、稳定发展奠定了基础。
本文利用RAPD和SCAR分子标记技术对同一来源栝楼块根经组织培养后分化成的不同性别的二年生栝楼进行研究,发现了在雄性栝楼中,可以稳定的得到一条569bp的条带,而雌性栝楼中没有。该结果为栝楼苗期性别鉴定筛选提供了新的途径,为进一步的栝楼性别分化的机理研究提供了参考和依据。
主要试验研究内容与结果如下所述：
1.栝楼叶片含有多糖和多酚,通过改良的CTAB法,所提取的栝楼基因组DNA效果较好,其OD260/OD280的值均在1.7～1.9之间,通过1.5%琼脂糖凝胶电泳后,谱带明亮清晰,没有拖尾现象,能够满足PCR扩增需要。
2.采用L16 (44) RAPD反应体系正交实验设计,对RAPD-PCR影响反应较大的Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶、dNTPs、引物浓度进行4因素4水平正交实验设计。优化后的反应体系为：在25μL反应体系中,含10×buffer 2.5μL,Mg2+2.0mmol·L-1, TaqDNA聚合酶1U,引物0.8μmol·L-1,dNTPs 0.1mmol·L-1。反应程序为94℃预变性2mim；94℃变性0.5mim,37℃退火40s,72℃延伸1.5mim,36次循环；72℃延伸10mim,4℃保存。
3.利用92个随机引物对雌、雄栝楼DNA分别进行PCR扩增,共产生大约600多条带,经过多次重复,发现在所选择雌、雄性栝楼样品DNA之间出现的差异性的引物只有1条。
4.采取上述优化体系,找到1条引物S1200(序列5'-GTGAACGCTC-3')能在雄性栝楼DNA中产生1条600bp左右的特异性的扩增带,将这一特异条带命名为S1200-600。经过多次重复试验,结果表明其重复性较好。
5.对S1200-600进行回收、克隆和测序,得到569bp的序列,根据测得的序列,利用Primer Premier5.0软件设计了一对特异性引物,通过退火温度的筛选,最终选择55℃为最适合的退火温度,得到适合于SCAR标记的体系为：在25μL反应体系中,含10×buffer 2.5μL,Mg2+2μL,TaqDNA聚合酶0.2μL,引物Ⅰ2μL,引物Ⅱ2μL,dNTPs0.25μL。反应程序为94℃预变性2mim；94℃变性50s,55℃退火温度40s,72℃延伸1.5mim,36次循环；72℃延伸10mim,10℃保存。经过多次验证,最终成功实现RAPD转化为SCAR标记。可作为栝楼品种早期性别鉴定的遗传标记。
【关键词】：栝楼 RAPD SCAR 性别 【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：S567.239
【目录】：
- 摘要3-5
- Abstract5-7
- 目录7-9
- 1 文献综述9-17
- 1.1 植物的性别9-10
- 1.2 植物性别的经济价值10
- 1.3 葫芦科植物性别概述10-11
- 1.4 栝楼的性别鉴定11-15
- 1.4.1 栝楼简介11
- 1.4.2 形态学鉴定11-12
- 1.4.3 生理生化研究12-13
- 1.4.4 植物激素13-14
- 1.4.5 分子生物学14-15
- 1.5 DNA分子标记技术15
- 1.6 RAPD-SCAR分子标记技术15-17
- 2 引言17-19
- 2.1 研究意义17
- 2.2 研究目的17
- 2.3 研究内容及技术路线17-19
- 3 材料与方法19-25
- 3.1 材料19
- 3.2 试剂与仪器19-20
- 3.2.1 主要试剂19-20
- 3.2.2 主要实验仪器20
- 3.3 方法20-25
- 3.3.1 DNA提取方法20-21
- 3.3.2 DNA质量和纯度的检测21
- 3.3.3 RAPD反应体系的确定21-22
- 3.3.4 随机引物进行PCR扩增获得与性别相关的RAPD标记22-23
- 3.3.5 栝楼性别基因RAPD标记的回收、克隆及序列测定23-24
- 3.3.6 特异性引物PCR扩增获得SCAR分子标记24-25
- 4 结果与分析25-33
- 4.1 DNA的提取结果25-26
- 4.1.1 栝楼雌、雄植株总DNA测定结果25
- 4.1.2 栝楼雌、雄植株总DNA电泳结果25-26
- 4.2 扩增条件优化结果26-29
- 4.2.1 正交设计直观分析评分26-27
- 4.2.2 各因素对PCR反应影响的差异分析27-29
- 4.2.3 最终优化结果29
- 4.3 DNA随机引物扩增片段多态性29
- 4.4 利用RAPD分子标记方法鉴定栝楼性别29-30
- 4.5 RAPD转化为SCAR标记30-33
- 4.5.1 特异条带的克隆测序30-31
- 4.5.2 引物设计及SCAR-PCR扩增退火温度的筛选31-32
- 4.5.3 SCAR分子标记结果32-33
- 5 讨论33-35
- 5.1 试验材料的重要性33
- 5.2 关于栝楼雄性基因分子标记的应用33
- 5.3 栝楼RAPD体系的筛选33-34
- 5.4 栝楼雌、雄的RAPD标记34
- 5.5 栝楼性别的RAPD标记转化为SCAR的初步研究34-35
- 6 结论35-36
- 附录A 不同性别栝楼RAPD的引物筛选36-38
- 参考文献38-42
- 致谢42-43
- 作者简介43
快捷付款方式
订购知网充值卡
订购热线
帮助中心