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《安徽农业大学》 2010年
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山羊精子蛋白质组学技术体系优化及冻融前后精子差异蛋白分析

阮崇美  
【摘要】: 蛋白质组学及其技术是21世纪生命科学研究热点领域之一,它标志着生命科学的研究进入了后基因组时代。蛋白质作为精子发挥生物学功能的物质基础,已经成为学术界研究的热点,蛋白质组学在人类医学领域得到广泛运用,特别在男性生殖领域取得了一定的成果,但在动物繁殖领域鲜有报道,特别是绵、山羊精子蛋白质组学及精子冷冻损伤的蛋白质组学机理尚未见相关研究报道。本试验以黄淮山羊的鲜精和冻精为试验材料,运用蛋白质组学原理对精子蛋白提取制备方法、蛋白组电泳分离、蛋白染色方法和2-DE电泳程序进行优化,从而优化了山羊精子蛋白质组学研究技术体系;利用比较蛋白质组学方法分析冻融前后山羊精子蛋白质的变化规律,通过软件分析寻找差异蛋白质,旨在通过揭示冷冻导致蛋白质组结构和功能改变的实质来阐明精子超低温冷冻损伤的机理,为促进精液冷冻保存技术的发展提供理论依据。结果表明:(1)采用改进的热Trizol方法分离提取山羊精子蛋白,较报道的尿素-盐酸胍两步裂解法操作更简单易行,提取效率高,蛋白制备完全,可重复性高。(2)运用11cm(pH 3-10)的固相胶条结合优化后的等电聚焦程序,得到的图谱背景清晰、凝胶上蛋白质点多,蛋白质点间距增宽,重叠蛋白点少,蛋白点分辨率高,拖尾现象避免。(3)运用考马斯亮蓝法和银染法作对比,结果显示蛋白对银染法的灵敏度高些,可分辨低丰度的蛋白,独立的蛋白点更多,分布也更广泛,但与考马斯亮蓝染色法相比较差异不明显。(4)对2-DE电泳程序进行优化,采用主动水化50V、16.5h,S1和S2步的除盐彻底保证了S3步的电压能顺利提升到4000V,从样品的聚焦效果可以看出,避免了横向拖尾,蛋白点分离较好。(5)采用以上优化程序和方法,对鲜精和冻精精子蛋白的2-DE电泳图谱做了比较发现:鲜精的蛋白位点重复性较高的有650±10个,冻精的蛋白位点重复性较高的有600±10个。冷冻导致精子蛋白丢失约为50个,而且冻精多表现为大分子量蛋白的丢失,大部分分布于60KD-100KD之间,其中60KD-80KD之间蛋白丢失约18个,80KD-100KD之间蛋白丢失近20个,12KD-60KD之间蛋白丢失近12个。 综上所述,本研究优化的山羊精子蛋白质组学研究技术体系,重复性高,稳定性好,初步确定了冷冻引起的山羊精子缺失的差异蛋白质点数目,适合山羊精子蛋白质组学更深入的研究,为后续的一级质谱、串联质谱技术及生物信息学方法鉴定差异蛋白奠定了基础。
【学位授予单位】:安徽农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S827

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