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《安徽农业大学》 2010年
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四种蛋传性病毒病多重PCR检测方法的建立

吴萍萍  
【摘要】: 近年来,随着规模化养殖的迅速发展,由禽网状内皮增生症病毒(REV)、鸡传染性贫血病毒(CAV)、禽白血病病毒(ALV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、禽脑脊髓炎病毒(AEV)等多种蛋传性病毒引起的疫病在我国鸡群中普遍存在,且常出现多重感染,给养鸡业造成了巨大的经济损失。这些蛋传性病毒除引起亲代自身直接发病、慢性持续性感染、慢性肿瘤、免疫抑制等危害之外,更重要的是通过种蛋垂直传播子代形成新一轮感染。若是SPF种鸡感染蛋传性疾病,会通过鸡胚污染疫苗所造成的后果更是不堪设想。为此,本研究旨在建立一种针对鸡REV,CAV,ALV和ARV四种常见蛋传性病毒的快速、准确、灵敏的检测方法。 试验首先对REV,CAV,ALV和ARV进行增殖,REV和ALV用CEF成纤维细胞增殖,ARV和CAV用SPF鸡胚增殖。分别对四种病毒的相关基因进行了同源性分析,筛选出了REV HA9901株LTR基因序列、CAV SD24株VP3基因序列、ALV HPRS103株的GP85蛋白基因序列、ARVS1113株S4基因序列作为PCR的扩增引物序列,分别建立了REV,CAV,ALV和ARV单项PCR检测方法。并对建立的方法进行了优化如退火温度、Mg2~+浓度、引物浓度、酶浓度的优化;结果,这四种病毒引物扩增片段大小分别为409bp、580bp、1260bp、207bp,退火温度、引物浓度、Mg2~+浓度、酶浓度分别为53℃、1.5μL、1.5μL、0.5μL。经序列分析、敏感性试验、特异性试验和可重复性试验表明,所建立的单项PCR方法可用于临床病料、细胞毒及鸡胚毒的检测。 其次,试验在建立的单项PCR方法的基础上建立了REV-CAV-ALV-ARV四重PCR方法。并对建立的方法的条件进行了优化;试验结果确定最终的退火温度、引物浓度、Mg2~+浓度、酶浓度。应用建立的方法对采自安徽省30份临床病料,分别采用单项PCR扩增和四重PCR方法检测,符合率可达93%,证明所建立的四重PCR方法稳定可靠。 最后,应用该法对临床80份送检病料、5个种鸡场100枚种蛋进行检测,结果表明该四种蛋传性病毒病鸡群普遍存在,混合感染情况严重。某生物制品厂应用该方法对114批禽胚生产的活疫苗,有3批检测CAV阳性、2批检出ALV阳性,与该厂质检部成品活疫苗外源病毒鸡检法结果相吻合;对120批SPF种蛋和鸡胚进行检测,仅2批ALV检出阳性。经初步应用表明本研究建立鸡REV、CAV、ALV和ARV四种常见蛋传性病毒四重PCR方法,可用于临床诊断、流行病学调查、禽胚生产活疫苗及种蛋检测,具有重要的应用价值,达到预期目标。
【学位授予单位】:安徽农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S854.43

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