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产γ—谷氨基甲酰胺合成酶的菌株的选育

张亚丽  
【摘要】: γ-谷氨基甲酰胺合成酶(γ-glutamylmethylamide synthetase,γ-GMAS)(EC 6.3.4.12)是一种连接酶,可在ATP和Mn~(2+)存在的条件下催化谷氨酸和甲胺合成γ-谷氨基甲酰胺。γ-谷氨基甲酰胺与茶氨酸(γ-谷酰基乙酰胺)的结构很相似,因此在一定条件下γ-谷氨基甲酰胺合成酶可同样催化谷氨酸和乙胺合成茶氨酸,这为茶氨酸的合成提供了又一思路。 目前国外报道该酶主要存在于细菌体内,包括普通生丝微菌,假单胞菌以及一些以甲胺为唯一碳氮源的海生甲基营养生物。近年来国外关于γ-谷氨基甲酰胺合成酶合成茶氨酸的研究报道较多,但是尚未见到关于假单胞菌液态发酵生产γ-谷氨基甲酰胺合成酶的相关报道,鉴于此,本论文对假单胞菌液态发酵生产γ-谷氨基甲酰胺合成酶进行了研究。首先利用紫外线诱变假单胞菌,从中筛选出产γ-谷氨基甲酰胺合成酶酶活较高的优势突变菌株;然后通过Plackett-Burman和RSM响应面设计优化发酵条件,提高酶产量;最后对γ-谷氨基甲酰胺合成酶进行粗提并研究了其部分酶学性质,以期为γ-谷氨基甲酰胺合成酶的进一步研究提供理论基础和科学依据。 主要研究结果有: 首先,以假单胞菌为出发菌株,对其进行紫外诱变处理,经过初筛复筛获得了一株产γ-谷氨基甲酰胺合成酶酶活较高并且遗传稳定性较好的优势突变菌株UV-19。 其次,以紫外诱变获取的优势突变菌株为实验菌株,发酵所产γ-谷氨基甲酰胺合成酶酶活为指标,筛选出了发酵产酶的最适碳源、氮源、溶氧转速、培养温度、培养时间、诱导底物,并通过Plackett-Burman(PB)设计筛选发酵培养的主要影响因素,确定了突变菌株液态发酵产酶培养基主要影响因素为葡萄糖(p=0.0003)、蛋白胨(p=0.0244)、起始pH值(p=0.0033)和装液量(p=0.0122)。 再次,在PB设计实验的基础上,以γ-谷氨基甲酰胺合成酶酶活为指标,运用响应面法(Response Surface Methodology, RSM)的旋转中心组合试验设计对筛选出的主要影响因素进一步优化,确定了优势突变菌株发酵产γ-谷氨基甲酰胺合成酶最适宜的发酵产酶条件:葡萄糖15.0g/L、蛋白胨12.0g/L、氯化钠5.0 g/L、硫酸镁0.2 g/L、磷酸二氢钾0.5 g/L、甲胺盐酸盐1.0g/L、起始pH值6.5、装液量72m L/250m L、发酵时间42h、温度30℃、转速160r/min。 最后,对优势突变菌株所产γ-谷氨基甲酰胺合成酶进行粗提,对粗酶的部分特性(最适温度及温度稳定性,最适pH及pH稳定性,金属离子等的影响)进行研究,确定该酶与底物的最佳作用时间为40min,最适反应温度为40℃,10-30℃间稳定性较好,最适反应pH为7.5,pH5.5-6.5范围内稳定性较好,金属离子Mn~(2+)、Mg~(2+)对γ-谷氨基甲酰胺合成酶有一定的激活作用。


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