两种植物NPR1基因的克隆及其对杨树转化的研究

【摘要】：杨树是世界上中纬度地区广泛栽培的重要树种,然而杨树的病害,特别是杨树的溃疡病,叶锈病和黑斑病,严重影响了杨树的生长发育,造成了较大的经济损失。系统获得性抗性(systemic acquired resistance,SAR),亦称广谱抗性。植物产生SAR后,能在较长时间内保持对多种病原菌的增强抗性。通过调节SAR反应来获得广谱抗病性的途径极具发展前景。近年来,大量的实验证明拟南芥AtNPR1基因在拟南芥中调控着SAR反应,过量表达AtNPR1基因可以使拟南芥产生SAR反应,同时对多种植物病原菌的抗性都有了显著的提高。 本文以中林2001杨树品种叶片为外植体,选用了6-BA和NAA不同激素浓度的6个处理,筛选杨树叶片分化的最佳培养基配方;克隆了拟南芥AtNPR1基因,并构建了表达载体pBI121+ AtNPR1,开展农杆菌介导的杨树遗传转化,并对转化植株进行了抗生素筛选和PCR分子鉴定;同时,采用生物信息学的方法分析了杨树NPR类型的基因,获得了候选基因,并克隆杨树PtNPR1基因。获得了以下主要结果: 1、进行了中林2001杨叶片直接诱导不定芽的研究,获得叶片分化的最佳培养基配方为MS+ NAA 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L +2 %蔗糖。 2、克隆了拟南芥AtNPR1基因,构建含CaMV35S组成型启动子和卡那霉素筛选基因的表达载体pBI121+ AtNPR1,并利用冻融法将其导入农杆菌EHA105中。 3、利用叶盘法将表达载体导入南林95杨中,获得了经Kan抗性筛选的转基因植株5株,PCR分子鉴定获得了3株转化株。 4、采用生物信息学的方法,在全基因组水平上系统分析了杨树NPR类型的基因,从中获得了8条候选基因序列,进一步分析发现其中一条基因序列符合NPR类型基因的结构特征,并克隆得到该基因序列,同源比对分析结果。 本研究筛选中林2001杨叶片直接诱导分化成芽的最佳培养基配方;克隆拟南芥AtNPR1基因并构建了pBI121+ AtNPR1表达载体,并对南林95杨进行了遗传转化,获得了3株经分子证实的转化株;利用生物信息学的方法开展了杨树NPR类型基因的研究并克隆到PtNPR1基因,为培育高产、优质、广谱抗病的杨树新品种,进一步深入了解植物抗病机理提供了研究材料,也为其他树种的抗病基因工程改良奠定了理论基础。