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一株古尼拟青霉提取物清除自由基活性研究

章能胜  
【摘要】: 古尼拟青霉是一种具有很高药用价值、应用前景广泛的真菌。本研究对古尼拟青霉固体培养菌丝进行了清除自由基活性的研究,发现古尼拟青霉固体培养菌丝具有较强的清除自由基的活性。为了提高自由基清除剂的产量,以该菌株菌丝的自由基清除率为指标,进行了培养条件和活性物质提取工艺的研究。具体内容主要包括:营养性因子和非营养性因子对古尼拟青霉菌丝清除自由基活性的影响研究;活性组分的分离提取工艺和纯化技术路线;活性化合物的纯度鉴定和结构解析。 用二苯代苦味肼基自由基法(DPPH-TLC)和酶标仪法(DPPH-Microplate)对菌株RCEF4117固体培养菌丝甲醇提取物的清除自由基活性进行了定性和定量测定,发现其具有较强的清除自由基活性,在浓度为30mg/mL,于37℃下保温10min时,样品对0.2 mg/mL的DPPH自由基的清除率分别可达94.91%。HPLC-MS分析RCEF4117菌丝甲醇提取物成分较复杂,色谱图上有数十个峰,主要含有两个清除自由基活性成分,在HPLC色谱图上对应的保留时间分别为10.8 min和15.8 min,在MS色谱图离子流峰对应的保留时间分别为11.2 min和16.2 min。两个活性组分对应的离子流峰和紫外吸收峰都最强,是提取物中的主要成分,同时其对应的峰与周围峰的分离度很高,易制备出大量纯品。 通过正交实验对菌株清除自由基活性的培养条件进行优化,发现菌株RCEF4117产活性成分的最佳培养基组成为:蔗糖20g/L,玉米粉10 g/L,酵母粉5g/L,NaNO33 g/L, MgSO4-7H2O 0.5g/L, NaC10.5 g/L, CaCl21.0 g/L, VB 0.2 g/L。最佳培养工艺为:种龄4天,接种量10%,培养时间8天,培养温度25℃。 通过正交实验和响应面实验对菌株清除自由基活性物质提取工艺进行研究,发现菌株RCEF4117提取清除自由基活性物质的最佳工艺为:提取溶剂甲醇,提取温度37℃,提取功率80KHz,提取时间34 min,料液比1:30。在最优的提取条件下,古尼拟青霉固体培养菌丝自由基清除率模拟计算最高值为96.61%,实际测得值为96.58%,预测值与实际值基本一致。 采用反相高效液相制备色谱对菌株RCEF4117清除自由基活性组分进行制备,得到活性组分pg-1和pg-2。HPLC法和UV法对pg-1和pg-2纯度进行分析,初步判断pg-1和pg-2为纯品,同时,采用HPLC峰面积归一化法,计算分离到的pg-1和pg-2纯度分别为97.3%和97.1%。对pg-1和pg-2进行高分辨质谱检测,得到它们的真正分子式为C17H15NO6和C16H14O6。用DPPH-Microplate法对pg-1和pg-2进行清除自由基活性确认,pg-1和pg-2的自由基清除率分别为89.62%和75.45%,表明两种活性化合物的制备是成功的,活性没有丢失。


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