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《安徽农业大学》 2010年
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鸡MHCⅡ类分子基因片段原核表达及其单抗的制备与鉴定

叶平  
【摘要】: 主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)是脊椎动物中的一个高度多态性的基因群,其遗传变异对多数物种的抗病性与生存有重要影响。鸡MHCⅡ类(B-L)分子基因由非多态的α链基因和高度多态性的β链基因组成。编码产物提呈加工后的外源性抗原给CD4~+T细胞,在细胞介导免疫和体液免疫中起重要作用。为了建立鸡MHCⅡ分子的检测方法,进一步研究其基因的分子结构、免疫学功能。本研究进行了鸡MHCⅡ分子部分基因的原核表达、单抗制备与鉴定。 首先,通过生物信息学方法对GenBank数据库中登录的多个鸡不同个体MHCⅡ类α、β链基因序列进行比对分析,选取鸡MHC II类分子较为保守的两段序列,分别为α链第2~6外显子和β链第3~6外显子序列,参照GenBank中鸡MHCⅡα(登录号:AY357254)和MHCⅡβ(登录号:S66480)的mRNA序列以及pET-32a、pGEX-4T-1载体多克隆位点序列,分别设计两对引物,以本实验室克隆的鸡MHCⅡα链和β链基因构建的pEGFP-N1-Ⅱα与pEGFP-N1-Ⅱβ质粒为模板,分别构建四个表达重组质粒pET-32a-Ⅱα、pET-32a-Ⅱβ_(36)、pGEX-4T-1-Ⅱα和pGEX-4T-1-Ⅱβ_(36)。PCR鉴定和序列测定结果表明,各重组质粒构建成功。 其次,诱导原核表达四个融合蛋白His-Ⅱα、His-Ⅱβ_(36)、GST-Ⅱα和GST-Ⅱβ_(36),鉴定融合蛋白His-Ⅱα、His-Ⅱβ_(36)的表达形式,并优化其表达条件后进行大量表达。用酶解、反复冻融和超声相结合的方法裂解表达菌,提取融合蛋白,再对其进行纯化、透析复性。SDS-PAGE电泳检测结果表明,所构建的重组质粒均在大肠杆菌中得到表达,获得分子量约为44.0KD、35.8D、50.0KD、41.8KD的融合蛋白,与预期结果相符,重组菌(pET-32a-Ⅱα、pET-32a-Ⅱβ_(36))均在0.2 mmol/L IPTG诱导4 h下表达效果最好,并获得了高纯度的以包涵体形式表达的融合蛋白His-Ⅱα、His-Ⅱβ_(36)。 最后,分别用纯化融合蛋白His-Ⅱα、His-Ⅱβ_(36)免疫Balb/c小鼠,获得的免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,制备相应的单抗,经间接ELISA筛选、Western-blot鉴定表明,分别成功制备了一株针对鸡MHCⅡα链的特异性单抗Ⅱα-4和两株针对鸡MHCⅡβ链保守区的特异性单抗Ⅱβ_(36)-2、Ⅱβ_(36)-31。间接ELISA测定制备的相应腹水效价分别为1:2.6×10~5、1:1.0×10~6和1:2.6×10~5。单抗亚类的鉴定结果显示,三株单抗均属于IgG1亚类。 综上所述,本研究成功地表达了鸡MHCⅡ类分子部分基因,获得了大量纯化的融合蛋白,制备了相应的单抗,并对获得的单抗进行了初步鉴定,为鸡MHCⅡ基因的分子结构、免疫学功能的进一步研究及临床检测奠定基础。
【学位授予单位】:安徽农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S852.4

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