杨树全基因组WRKY基因的鉴定及表达分析

【摘要】：WRKY蛋白是近年来研究较广泛的诱导型植物转录因子，其序列的氨基(N)末端含有高度保守的七肽WRKYGQK，能够与顺式作用元件W盒[(T)(T)TGAC(C/T)]发生特异性结合，从而调控下游靶基因的表达，参与植物的多种防卫反应、生长发育和代谢途径。目前，对WRKY基因家族的系统性研究主要集中在模式植物拟南芥和水稻中，而对其他物种特别是木本植物WRKY基因的研究较少。对木本植物基因组中WRKY基因进行鉴定和分析，将有助于完善该家族的功能及进化信息。本文利用生物信息学方法，以杨树最新基因及蛋白序列为材料，通过对杨树全基因组中WRKY转录因子进行鉴定，以期获得较为完整的杨树WRKY家族信息。同时，对该家族成员的分类、定位、结构、进化、基因复制、表达等情况进行全面分析，为下一步WRKY基因的功能研究奠定信息学基础。本文主要研究结果如下： 1.以毛果杨最新基因及蛋白序列为研究材料，运用多种生物信息学软件对其全基因组进行搜索、比对和筛选，同时结合Pfam在线工具验证，共获得104个WRKY类型基因。根据基因在染色体上的定位结果并结合已公布的三倍体杨WRKY基因命名特性，将预测得到的WRKY基因命名为PtWRKY1-104，获得较为完整的杨树WRKY基因家族信息。 2.对获得的杨树WRKY基因及保守结构域进行多重序列比对，并构建PtWRKY基因及结构域的系统进化树，两者得到了类似的进化关系。参照Somssich的分组原则并结合杨树WRKY域多重比对结果对其进一步分组。这样杨树WRKY基因可分为三大类(I、II、III)及7个小亚类，其中I组包括Ia和Ib亚组，II组包括IIa、IIb、IIc、IId和IIe亚组。 3.对获得的126个WRKY域进行蛋白序列分析，发现杨树WRKY基因家族中一些成员存在核心序列变异。序列WRKYGQK存在以下四种变异： WRKYGKK、WKKYGQK、WRKYGRK和FWRKYGQK。其中FWRKYGQK变异类型未见报道。WRKY结构域氨基酸序列的结构有以下五种模式，即C-X4-C-X21-HXH、C-X4-C-X22-HXH、C-X4-C-X23-HXH、C-X5-C-X19-HXH和C-X5-C-X23-HXH。 4.利用MEME在线网站，对获得的WRKY蛋白进行保守基序分析。预测结果显示在PtWRKY基因中可以找到多个保守基序，同一类型的WRKY基因含有的基序类型和数目具有一定的相似性。同时，1、2、3、5和11号保守基序被鉴定为PtWRKY蛋白核心序列，这些序列广泛的分布于杨树WRKY基因家族中。 5.86条WRKY基因在进化过程中存在明显的基因复制现象，大约占整个杨树WRKY基因的83%。其中近似有69%的基因参与了片段复制事件。对基因的内含子剪接位点进行分析，发现几乎所有的基因在其WRKY域中都存在一个保守的内含子剪接位点。 6.利用PopGeneIE网站，获得81个PtWRKY基因电子表达谱。分析表明WRKY基因在杨树不同组织中转录水平存在较大差异。利用半定量RT-PCR技术，对杨树WRKY第III组基因进行了逆境胁迫（低温、干旱、高盐）和水杨酸(SA)处理下的表达谱分析。结果表明PtWRKY基因在不同胁迫处理下表达水平存在明显差异。PtWRKY76基因在0.1mM SA或25%PEG-6000胁迫后，表达量显著升高。