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《安徽农业大学》 2017年
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新型鸭细小病毒DS-15株生物学特性研究及间接ELISA方法的建立

宫晓华  
【摘要】:2014年以来,在我国许多樱桃谷肉鸭养殖地区广泛流行一种“鸭大舌病”,其临床症状主要表现为鸭生长发育迟缓,鸭喙萎缩舌头外露下垂,跛行瘫痪等,又称鸭短喙-侏儒综合征。已经鉴定出该病的病原是一种新型鸭细小病毒(Novel duck parvovirus,NDPV)。目前对此病毒的生物学特性暂不清楚,临床上还没有有效的疫苗或药物行防治,也没有检测该病毒的方法或技术。为此,本研究对NDPV DS-15株的生物学特性进行了研究,同时为了给该病的流行病学调查提供一个可靠的检测方法,我们还对NDPV的主要抗原蛋白VP3进行了表达和纯化,并在此基础上建立了检测NDPV抗体的ELISA方法。首先,我们对新型鸭细小病毒DS-15株在鸭胚上的增殖特性及对鸭胚的致病力进行研究。试验结果显示,鸭胚接种NDPV DS-15株以后,96~120 h出现死亡,胚体全身出血,病毒滴度(ELD50)为10-5.5/0.2 mL。以鸭胚增殖的病毒感染樱桃谷肉鸭,成功复制出典型的“鸭大舌病”临床症状,并从发病鸭脏器中分离到病毒。其次,根据NDPV DS-15株的基因序列设计PCR引物扩增VP3基因并将其序列与国内外报道的部分GPV及MDPV分离株的VP3基因进行比对和分析。结果表明,NDPV DS-15株VP3基因与鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为91.4%~98.4%和96.6%~98.1%,而与番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)核苷酸和氨基酸同源性则较低,分别为81.4%~91.5%和91%~97%;在亲缘关系方面,NDPV DS-15株与GPV较近,提示二者可能是由同一病毒进化而来。最后,我们将NDPV的VP3基因克隆并插入到pGEX-4T-1中构建重组表达质粒pGEX-4T-VP3,诱导表达重组GST-VP3蛋白,重组蛋白分子量为84kDa。Western blot方法检测结果显示重组VP3蛋白能与NDPV多克隆抗体发生反应,重组VP3蛋白具备用作诊断抗原的潜力。以表达的VP3蛋白作为抗原,包被ELISA板;然后,分别对包被抗原的浓度及条件、抗原封闭条件、一抗的孵育条件、酶标二抗的孵育条件和显色条件等进行优化,最终成功建立间接ELISA方法,确定方法的阳性阈值为0.35。所建立的方法有较好的重复性,运用该方法对临床样本进行了初步检测,结果表明该方法可用于NDPV疫苗的免疫效力评价,及NDPV感染鸭群的流行病学调查,同时也可用于鸭群GPV的检测。综上,本论文对NDPV的增殖特性及致病特性进行了初步研究,推测新型鸭细小病毒与鹅细小病毒可能是从同一病毒祖先进化而来。此外,我们建立了检测NDPV抗体的间接ELISA方法,为开展NDPV的疫苗研发和流行病学调查等提供了可靠的检测方法。
【学位授予单位】:安徽农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.65

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