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《安徽农业大学》 2017年
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禽致病性大肠杆菌中Ⅲ型分泌系统2的分布及其组分EivC功能研究

许漩  
【摘要】:细菌通过分泌系统将蛋白质转运到细菌胞外或直接注入宿主细胞内,与细菌的生存及致病性密切相关。Ⅲ型分泌系统(TypeⅢsecretion system,T3SS)存在于致病性大肠杆菌、沙门菌等细菌中,与毒力因子的分泌及致病力有关。研究人员发现EHEC O157:H7存在与沙门菌SPI-1类似的毒力岛,将其命名为E.coli TypeⅢsecretion system 2(ETT2)。调查发现,不同致病性大肠杆菌中均含有ETT2毒力岛。尽管大部分ETT2毒力岛存在基因突变和缺失,其在黏附入侵、胞内生存、生物被膜形成等方面发挥重要作用。APEC(Avian pathogenic E.coli,APEC)属于肠道外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic E.coli,ExPEC),可以引起禽大肠杆菌病,给养禽业造成巨大经济损失。研究表明,APEC与人ExPEC基因组结构相似,具有许多相同的毒力因子和相似的致病机制。因此,APEC是人ExPEC的毒力基因贮库,对人类健康造成潜在威胁。为了阐明APEC中ETT2的分布及其致病机制,本研究对APEC中ETT2进行流行病学调查,并分析ETT2 ATPase EivC关键活性位点及其对APEC致病性的影响,为进一步研究ETT2在APEC中的致病机制提供参考。1.ETT2在APEC中的亚型及流行病学调查为了检测ETT2在APEC中的分布,本研究根据EHEC O157:H7的ETT2毒力岛序列设计8对重叠PCR引物,检测ETT2在APEC临床分离株中的分布。然后,对ETT2目的条带进行测序,分析ETT2亚型。同时,通过PCR方法鉴定APEC的血清型、进化分群,并分析ETT2与血清型、进化分群之间的关联性。结果发现57.6%(141/245)APEC分离株含有ETT2毒力岛。测序结果显示APEC中ETT2分为完整型ETT2(命名为A亚型)和缺失突变型ETT2(命名为B、C、D、E亚型)。血清型分析表明ETT2主要存在于O1、O2和O78血清型APEC中。此外,O78血清型APEC仅含有缺失突变型ETT2,而完整型ETT2主要存在于O1和O2血清型APEC中。分析发现,T3SS相关基因簇(eip)仅存在于完整型ETT2阳性菌株中。大肠杆菌进化分群分析显示,66.7%(32/48)B1、64.8%(35/54)D、59.6%(31/52)A、44.9%(35/78)B2进化分群APEC含有ETT2。然而,ETT2毒力岛和其他毒力基因分布没有关联性。本研究表明,APEC中ETT2的亚型及分布均显著高于人的ExPEC,进一步证明APEC对人类健康造成潜在威胁。2.ETT2毒力岛组分EivC克隆表达及其ATPase活性分析为了分析APEC ETT2毒力岛组分EivC的ATPase活性及其关键活性位点,本研究比对分析病原菌ATPase序列,分别设计克隆表达引物及点突变引物,然后构建重组表达质粒。经IPTG诱导表达后纯化相应蛋白,并检测其ATPase活性。结果显示,EivC蛋白包含F0F1 ATPase的保守序列Walker Box A、Walker Box B及DCCD Box,因此EivC可能属于ATPase。酶活试验结果显示,His-EivC融合蛋白具有ATPase活性,磷酸盐释放速率为0.28±0.08mmol/min/mg。根据病原菌ATPase的关键位点,选择EivC蛋白第175位赖氨酸、第199位精氨酸、第201位精氨酸、第233位精氨酸进行点突变,然而点突变与野生型EivC的ATPase活性无显著差异。故本研究表明ETT2毒力岛组分EivC为ATPase,但是第175、199、201、233位氨基酸不影响其ATPase活性。3.禽致病性大肠杆菌APCE94 eivC基因缺失株、互补株的构建及特性分析为了分析ETT2 ATPase EivC对APEC表型和毒力的影响,本研究利用Red同源重组系统构建APCE94的eivC基因缺失株,并利用低拷贝质粒pSTV28构建eivC基因互补株。然后比较分析野生株、缺失株与互补株的生长特性、运动性、抗血清杀菌能力、黏附/侵袭能力、HD-11细胞内存活能力、动物致病力等差异。通过荧光定量方法检测APEC鞭毛、菌毛、毒力基因及HD-11细胞的细胞因子的表达水平;并通过透射电子显微镜观察细菌表面形态变化。结果显示,与野生株相比,eivC缺失株的生长特性无显著变化,但其运动性显著降低。电镜检测结果表明eivC缺失株表面的鞭毛减少,而菌毛增加,从而导致细菌运动性降低,荧光定量PCR结果显示鞭毛和毒力基因表达下调。另外,eivC缺失导致其抗血清杀菌能力、HD-11胞内存活能力显著下降。动物试验结果表明APEC94ΔeivC对雏鸭的致病力、体内存活和定殖能力显著降低。细胞炎症因子荧光定量分析发现缺失株APEC94ΔeivC感染HD-11细胞后IL-1β和IL-8显著上调,其可能与ETT2及其效应因子相关。研究结果表明,ETT2毒力岛ATPase EivC参与APEC的运动性和致病性。
【学位授予单位】:安徽农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.61

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