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《安徽农业大学》 2017年
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鸭坦布苏病毒E蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫原性的初步研究

王瑞  
【摘要】:鸭坦布苏病毒病(Duck Tembusu virus disease)是由鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)引起的以成年蛋鸭产蛋下降,生长发育迟缓并可导致雏鸭死亡的一种传染病。免疫接种是预防与控制该病的关键性措施之一。本研究利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达DTMUV的重要免疫原基因(E基因),并对表达的重组E蛋白进行了免疫原性初步研究。首先,根据DTMUV AH-F10株的E基因全基因序列设计引物,以含有DTMUV AH-F10株E基因的pMD19-E质粒为模板扩增E基因,并将其插入杆状病毒骨架载体:pFastbac载体中,再将鉴定正确的重组质粒pFastbac-E转入DH10Bac感受态细胞,经过三次蓝白斑筛选获得含有重组质粒rBacmid-E的白色单克隆菌落,提取重组质粒并用PCR鉴定正确后,使用Cellfection转染sf9细胞,获得P1代重组杆状病毒rvBac-E,经PCR鉴定正确后,在sf9细胞中传代至P4代,测得P4代rvBac-E的TCID50为10-5.5/0.1mL。分别用Western blot和IFA鉴定重组杆状病毒,结果均证明,所构建的rvBac-E可在sf9细胞中有效表达E蛋白,且表达的重组E蛋白具有良好反应原性。将上述重组病毒在Sf9细胞中大量扩增后,收集细胞培养物冻融3次,再高速离心去除细胞碎片,获得高水平表达的重组E蛋白。然后以该重组E蛋白为抗原免疫樱桃谷肉鸭,检测其免疫原性。将7日龄樱桃谷雏鸭分为4组,免疫重组E蛋白(4×106cells/只)为试验组;以wtBac感染sf9细胞裂解液为空Bacmid组;设置DTMUV AH-F10株全病毒油乳剂灭活苗为阳性对照组、接种等剂量PBS为阴性对照组。2周后进行加强免疫。免疫前、后分别对各组雏鸭颈静脉采血,分离血清,进行E蛋白特异性抗体、中和抗体、IL-4、IFN-γ细胞因子检测,同时分离外周血进行淋巴细胞增殖试验。二次免疫后2周使用DTMUV AH-TL15株进行攻毒保护试验,每只0.5mL(ELD50为10-2.38/0.1mL)。试验结果显示,试验组樱桃谷雏鸭首免2周后特异性抗体,血清中和抗体,IL-4、IFN-γ细胞因子水平显著上升,与阴性对照组、空Bacmid组樱桃谷雏鸭差异显著(P0.05);淋巴细胞增殖试验发现试验组淋巴细胞SI值较阴性对照、空Bacmid组差异显著(P0.05)。攻毒保护试验结果表明,试验组樱桃谷雏鸭的保护率为80%,阳性对照组的保护率为100%,阴性对照组和空Bacmid组雏鸭全部发病。病理切片观察结果显示试验组和阳性对照组雏鸭均未见病变,而阴性对照组和空Bacmid组在肝脏出现脂肪变性,淋巴细胞浸润;脾脏核固缩,出血;胰脏淋巴细胞浸润;大脑血管“袖套样”病变,有噬神经细胞现象。综上,本研究在sf9细胞中成功表达了DTMUV E蛋白,该重组E蛋白可以有效诱导樱桃谷雏鸭产生体液免疫和细胞免疫,并能在一定程度上保护樱桃谷雏鸭抵御病毒攻击。提示本研究以昆虫细胞表达的重组E蛋白具有作为研制抗DTMUV感染的新型疫苗的潜力。
【学位授予单位】:安徽农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.65

【参考文献】
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