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《安徽农业大学》 2016年
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柞蚕抗菌肽Cecropin-like的鉴定与功能分析

方绍亮  
【摘要】:柞蚕是一种重要的绢丝昆虫。本研究从大肠杆菌诱导处理的柞蚕转录组中筛选得到一新的抗菌肽Cecropin-like(ApCec)。利用软件EditSeq预测其ORF框含195个核甘酸。解剖得到大肠杆菌诱导的柞蚕幼虫组织并提取RNA再反转录得到cDNA模板体。通过扩增、连接、转化、测序以及核酸序列比对确定所发现抗菌肽ApCec基因在柞蚕体内真实存在且与转录组中对应的核酸序列一致。抗菌肽ApCec全长cDNA编码的肽含有64个氨基酸残基,这其中包括一个含22个氨基酸残基的预测信号肽,4个氨基酸残基的前肽和38个氨基酸残基的成熟肽。氨基酸序列比对表明成熟抗菌肽ApCec与其他成熟抗菌肽Cecropin氨基酸序列比较保守。利用已公开报道抗菌肽Cecropin的氨基酸序列以及预测的抗菌肽ApCec氨基酸序列构建进化树显示总共聚为双翅目与鳞翅目两簇,抗菌肽ApCec归属于鳞翅目簇且与该簇内聚为更小一簇抗菌肽Cecropin同源性较高。用大肠杆菌(Escherichia coli)诱导柞蚕24 h后通过定量PCR检测抗菌肽ApCec在脂肪体、马氏管、丝腺、中肠、血细胞以及表皮组织中的分布,结果显示抗菌肽ApCec基因在脂肪体、马氏管、血细胞以及表皮中表达水平均较高,而其在马氏管中表达水平最高。本研究中人工化学合成了两个肽:pro-ApCec(含前肽和成熟肽)和M-ApCec(成熟肽),且合成的两个肽都分别用高效液相色谱检测其纯度以及用质谱检测其分子量。通过MIC实验和抑菌圈试验发现,抗菌肽M-ApCec抗大肠杆菌K12(Escherichia coli K12)或枯草杆菌(Bacillus subtilis)活性都比抗菌肽pro-ApCec更强,同时抗菌肽M-ApCec抗菌具有剂量效应。以小鼠血细胞为抗菌肽M-ApCec作用对象,该溶血性实验表明成熟的抗菌肽M-ApCec对以小鼠血细胞为代表的哺乳动物细胞毒性较低。通过圆二色谱法检测抗菌肽M-ApCec在亲水环境和疏水环境中结构,结合曲线图和所算数据表明抗菌肽M-ApCec在亲水环境中二级结构呈不规则状态而在疏水性环境中二级结构为α-螺旋。用抗菌肽M-ApCec处理革兰氏阴性菌大肠杆菌K12和革兰氏阳性菌枯草杆菌,并用透射电镜观察细胞,实验结果显示大肠杆菌K12和枯草杆菌细胞膜被破坏,说明抗菌肽M-ApCec通过破坏细菌细胞膜的完整性从而达到杀死细菌的目的。本研究结果说明抗菌肽ApCec在柞蚕体内为抵御病原微生物对柞蚕的侵害发挥着重要作用,同时通过对新发现抗菌肽ApCec的研究为后续更为深入的研究奠定了基础,为其在抗菌药物开发和疾病控制方面应用提供借鉴。
【学位授予单位】:安徽农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S885.1

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