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《安徽农业大学》 2016年
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柞蚕血淋巴蛋白酶6基因的表达模式及功能分析

杨柳  
【摘要】:柞蚕(Antheraea pernyi)是鳞翅目大蚕蛾科柞蚕属的一种绢丝昆虫,具有重要经济价值,已有研究表明丝氨酸蛋白酶在体液免疫(抗菌肽合成与血淋巴黑化)中起到关键作用,为了能够更全面的了解血淋巴蛋白酶(Hemolymph proteinase6,HP6)在鳞翅目昆虫先天性免疫中的功能。本论文研究了柞蚕血淋巴蛋白酶6(ApHP6)的表达模式以及其在体液免疫中生物学功能。研究结果如下:1.成功构建了原核表达质粒pET-28a-ApHP6,并在大肠杆菌中成功表达了融合蛋白,经检测成熟的目的蛋白分子量大小为39.6 kDa,和预测的分子量一致。在天然条件下利用Ni-NTA亲和层析纯化对重组蛋白进行纯化,获得了高纯度的目的蛋白,免疫新西兰大白兔获得抗ApHP6多克隆抗体,并用于后续的功能分析;2.实时定量PCR和Western Blot检测分析表明ApHP6在5龄3天幼虫血细胞、血淋巴、丝腺、脂肪体、中肠、马氏管中都有表达,且ApHP6基因在血细胞和ApHP6蛋白在血淋巴中高表达,中肠中表达量最低;3.对5龄第3天柞蚕幼虫分别注射热灭活大肠杆菌(Escherichia coli)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、白僵菌(Beauveria bassiana)、核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus),利用实时定量PCR检测血细胞中ApHP6的转录表达水平和Western Blot检测血细胞、血淋巴中ApHP6的蛋白表达情况。与注射PBS对照相比较,结果表明除E.coli以外,其他三种病原微生物的免疫刺激,随着时间变化都能显著的影响ApHP6 mRNA和蛋白水平的表达,但是影响的时间和程度都不同;4.利用表达纯化的ApHP6蛋白检测了ApHP6对柞蚕血淋巴proPO激活及PO活性的影响。结果表明ApHP6蛋白能够促进血淋巴proPO的激活,但是对PO活性没有影响;5.将ApHP6蛋白注射进柞蚕幼虫体内,30 min后注射M.luteus刺激抗菌肽的表达,实时定量PCR检测结果表明血细胞中抗菌肽attactin,cecropin,gloverin和moricin及proPO的表达在mRNA水平上具有显著性的升高,说明ApHP6蛋白能够一定程度上激活AMPs基因和proPO的转录表达水平。6.注射si RNA-ApHP6后,对应的抗菌肽基因和proPO的表达水平有明显下调。说明ApHP6的RNA干扰后能够降低柞蚕AMPs和proPO的表达,进一步推论出,柞蚕AMPs和proPO的表达可能随着ApHP6被抑制而下调。综上所述,本研究的结果表明ApHP6在柞蚕的先天性免疫应答中可能扮演重要的角色,为进一步从分子水平上解释血淋巴蛋白酶与柞蚕先天性免疫的关系,以及对柞蚕和鳞翅目昆虫的先天性免疫调控作用机理的研究具有重要的参考意义。
【学位授予单位】:安徽农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S885.1

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