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《安徽农业大学》 2003年
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抗除草剂bar基因表达载体的构建及农杆菌转化的研究

檀琮萍  
【摘要】: 杂草与农作物竞争水分、养料和光照,影响农作物的产量、品质,还是许多病害的中间寄主或越冬场所,通过除草剂来控制杂草已成为现代化农业不可缺少的一部分。但除草剂在消灭杂草的同时也对作物产生了伤害作用。目前,利用基因工程手段培育抗除草剂的作物品种解决了这一矛盾。 广谱、非选择性除草剂Basta的活性成分是草丁膦(Phosphinothricin)。草丁膦除草作用机理是抑制植物的氨基酸生物合成酶—谷氨酰胺合成酶(GS),使杂草产生氨中毒。bar基因编码草丁膦乙酰CoA转移酶(PAT),可催化草丁膦的自由氨基乙酰化,从而使除草剂草丁膦失活。而且bar基因也是迄今为止应用最为广泛的一个抗除草剂选择标记基因,克隆出bar基因对植物的遗传转化,基因表达和生理学研究都有重要的作用。 本实验从抗除草剂转基因Bobwhite小麦中,利用PCR克隆的方法扩增出bar基因全长,并在原核表达系统中表达,鉴定表达蛋白的活性,将能够正确编码PPT乙酰转移酶的bar基因片段,经过适当的修饰构建入真核表达载体。并将此构建的真核表达载体转化农杆菌获得工程菌,为基因转化及农杆菌转化做了前提工作。并对农杆菌转化小麦体系作了初步的研究,为选育出适宜在安徽麦区种植的高产、优质、抗除草剂小麦新品种做了基础工作。本实验研究结果表明: 1.利用PCR方法对已知序列基因的克隆是简单有效的方法,但很多因素影响PCR的特异性,其中退火温度起着关键性作用。本实验采用了高保真pfu DNA聚合酶,在退火温度61℃条件下从转基因Bobwhite品种基因组DNA中扩增出特异性片段,将此片段插入克隆载体pGEM-7fz(+),经测序和序列分析表明,所扩增得到的片段含有bar基因完整的读码框,并且序列与GenBank中发表的序列完全一致。 2.选用pET32a表达载体和BL21trxB(DE3)宿主菌的原核表达系统,对扩增得到的片段进行表达鉴定。经IPTG诱导表达的融合蛋白的分子量39.6kDa,目的片段表达蛋白分子量20.1kDa,与预计的分子量20.0kDa相符。并且表达的蛋白酶(PAT)经DTNB比色法鉴定,具有酶活性。 3.为了目的基因在真核生物中有效的翻译和表达,通过PCR方法对bar基因起始密码子ATG旁侧序列进行改造。改造后的目的基因克隆于真核表达载体pBI121,构建表达载体pBI121-bar,通过三亲杂交法将真核表达载体pBI121-bar 转入农杆菌LBA4404,成功构建出工程菌。 4.小麦离体培养中,基因型、培养基激素浓度与外植体类型是影响小麦胚性愈 伤组织诱导和再生频率的3个主要因素。基因型的影响主要影响到胚性愈伤组 织的发生频率,以幼胚为外植体杨麦87158可以达到sl.35%,而安农92484 只能达到 16.sl%。在所试的品种中对于成熟胚在 2,4D质量浓度为 4.omg/L 时出愈率和胚性愈伤组织诱导率达到最大值,而对于幼胚不同品种表现有所差 异,其中杨麦871 58和安农98005在2,4*浓度为2.omg几时胚性愈伤组织诱 导率最高,而安农92484则是在4.omg几时效果较好。同时研究表明不同外植 体不仅影响到出愈率,更主要影响胚性愈伤组织的形成。 5.在转化后抗性愈伤组织筛选中,适应的PPT筛选浓度为3刀mg几,Cef有效抑 菌浓度为 200pg/ml,乙酚丁香酮有效诱导浓度为 100pmol几,0.5%表面活性剂 Tween20,可以使GUS染色均匀,但并不是T-DNA转移所必需,盐的浓度对 T-DNA转移影响不大。
【学位授予单位】:安徽农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:Q78

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【引证文献】
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