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《安徽农业大学》 2003年
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茶树β-葡萄糖苷酶基因克隆、表达和分布定位

李远华  
【摘要】:茶树体内的各种物质代谢、能量传递、信息转录以及生长发育等都必须有酶的参与,酶对茶叶品质形成具有重要意义,酶学研究是茶叶的重要理论。而β—葡萄糖苷酶与茶叶香气有关,香气是衡量茶叶品质好坏的重要指标之一。 β—葡萄糖苷酶属于水解酶类,存在于自然界许多植物体,还存在于一些酵母、曲霉菌、木霉菌属及细菌体内。它的特性是可水解结合于未端、非还原性的β-D-糖苷键,同时释放β-D-葡萄糖和相应的配基;此外还能微弱地水解对硝基苯-β-D-半乳糖和β-D-木糖苷。在纤维素的糖化作用中,β-葡萄糖苷酶功能是将纤维素二糖和纤维素寡糖水解成葡萄糖。根霉能在许多种纤维素物质上生长,正是由于它能产生包括β-葡萄糖苷酶在内的多种纤维素酶所致。 在茶叶上研究主要是该酶与萜烯类香气前驱体有密切关系,使糖苷键合态变成游离态。对茶叶中β-葡萄糖苷酶的研究,最早是1981年Takeo T利用茶叶匀浆试验,发现茶叶匀浆添加β-葡萄糖苷酶后,亦能产生芳樟醇和香叶醇,证实茶叶中存在以葡萄糖苷形式存在的单萜烯醇。目前对茶树β-葡萄糖苷酶的研究已深入到其与茶树品种、生态因子、加工工艺上。从分子生物学水平,研究β-葡萄糖苷酶基因克隆和表达,在燕麦、蜀黍、旱金莲、长春花、黄檀等许多植物中都有报道,但在茶树上至今国内外未见报道。 本实验针对β-葡萄糖苷酶研究现状,主要从以下几方面来研究:茶树β-葡萄糖苷酶cDNA的克隆及在原核中表达,茶树中β-葡萄糖苷酶基因mRNA表达和分布定位情况。 茶树β-葡萄糖苷酶cDNA的克隆,主要采用江昌俊等人方法提取茶树RNA和Gibco公司3′/5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒进行,研究结果表明,茶树β-葡萄糖苷酶cDNA全长序列1475bp,该序列的ORF由1350个核苷酸组成,编码450个氨基酸,5′非翻译区(5′-UTR)与3′非翻译区(3′-UTR)分别为33个和92个核苷酸组成。信号肽由28个氨基酸组成。预测序列氨基酸功能结构域有:4个N-豆蔻酰化位点(NSTK~(202)、NFTK~(206)、NRTQ~(238)、NRSS~(307),5个蛋白激酶C的磷酸化位点(SNR~(185)、STK~(202)、TSK~(247)、TLR~(270)、STR~(371)),2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(SIVF~(112)、TLNE~(350)),5个N-糖基化位点(GGHASK~(67)、GQASGS~(281)、GIRCCR~(288)、GGLCAA~(317)、GQKGSG~(331))。其核苷酸序列同 安徽农业大学博士学位论文:中文摘要 源性分析,与一些木本植物有比较高的相似性。与草本植物相对更低。从推导出的氨基 酸序列保守性来看,第88、420、614有氨基酸残基的G,第204个氨基酸残基Y,第345 个氨基酸残基I,其氨基酸序列完全保守,另有10%左右序列与部分植物比较一致。从 系统进化树来看,茶树与黄檀植物亲缘关系最近,与鼠耳芥中的一个种类(AY045953) 和小干松也比较相近,与大麦植物关系较远,而与玉米中的一个品种(U25157)关系最 远,反映了茶树与这些植物物种间差异较大。预测茶树母一葡萄糖昔酶二级结构可以形 成14.33%的a一螺旋、25.43%的日一折叠。 茶树p一葡萄糖昔酶在原核中表达,主要采用Novagen公司菌株点co1z’ BL21trxB (DE3)和表达载体pET一32a进行p一葡萄糖昔酶表达,酶活性测定参考张正竹的方法。 研究结果显示,实际诱导表达的茶树p一葡萄糖昔酶成熟蛋白分子量为37KDa, pET一32a/Mp一Glc融合蛋白在工PTG诱导3h的表达量最高,表达量占菌体总蛋白的32.2%, 表达的蛋白经测定具有正常的生物学活性。在诱导0h时没有表达蛋白,诱导o.sh时表 达的蛋白量很少,诱导lh、2h时表达量逐渐增加,诱导4h、7h时表达量也基本稳定在 3h的水平,表达量没有明显增多。不同培养温度对表达蛋白也有影响,在Ilnmol.L一‘工PTG 诱导3h,45℃与37℃表达量差不多,26℃比37℃表达量要少,26℃表达蛋白量在工PTG 诱导3h时仅37℃的1/10。采用0.1、0.5、Ilnmol.L一‘工PTG三种浓度诱导表达,37℃ 同样诱导3h,表达蛋白量差异不大。不同部位的表达蛋白存在形式来看,培养基组分中 没有发现目的蛋白,周质中也没有发现有表达蛋白,而原核细胞中可溶性细胞质蛋白和 不可溶的细胞质蛋白却有较多的表达,其中可溶性细胞质蛋白比不溶性多些,可溶性细 胞质蛋白占表达总蛋白的3/5,不可溶的细胞质蛋白占表达总蛋白的2/5。 茶树p一葡萄糖营酶mRNA变化研究,采用Roche公司地高辛RNA标一记试剂盒,原位 杂交过程参考武汉博士德公司的方法。表达结果茶树叶片的p一葡萄糖昔酶mRNA表达主 要部位在栅栏组织,上表皮、下表皮、海绵组织等其它的组织则只有较弱的表达信号; 叶片栅栏组织mRNA表达分布,在细胞核表达信号强,清晰、色明,细胞质部分有表达信 号,其中包括液泡等部分细胞质没有表达信号;叶片的海绵组织内,细胞核有表达信号, 但比栅栏组织弱,少部分的细胞质有表达信号;叶片上表皮细胞核有弱表达信号,细胞 质只有少部分有表达信号;叶片下表皮细胞核有弱表达信号,细胞质部分有表达信号。 茶树叶主脉的p一葡萄糖营酶基因mR琳表达部位在薄壁组织,韧皮部也很难观察到表达 安徽农业大学博士学位论文:中文摘要 信号,而上、下表皮和?
【学位授予单位】:安徽农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S571.1

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【引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
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3 李娟;安吉白茶高氨基酸相关基因分离及鉴定[D];湖南农业大学;2007年
4 张娴静;不同工艺铁观音香气形成的生化及分子生物学机制研究[D];福建农林大学;2012年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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9 王霞;庞劲松;亓宝;胡兰娟;袁慧;;人工合成异源六倍体小麦β-葡萄糖苷酶活性的变化[J];安徽农业科学;2009年34期
10 苏媚;方向明;阚雪芹;王海玲;刘文倩;谈建中;;观赏植物“孩儿莲”及其近缘植物的RAPD分析[J];安徽农业科学;2010年10期
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1 刘振;赵洋;杨培迪;成杨;杨阳;;茶树SRAP反应体系优化及引物筛选[A];科技创新 转型升级 做大做强湖南特色茶叶——湖南省茶叶学会2011年学术年会论文集[C];2011年
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6 易松强;郑火青;张翠平;魏文挺;胡福良;;蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活性测定及来源的研究[A];“蜂之巢”2010年全国蜂产品市场信息交流会暨中国(武汉)蜂业博览会论文集[C];2010年
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8 陈常颂;林政和;王秀萍;陈荣冰;;“奇兰”种质资源的遗传多样性研究[A];第四届海峡两岸茶业学术研讨会论文集[C];2006年
9 林郑和;陈常颂;陈荣冰;;我国39个茶树品种的RAPD分析[A];第四届海峡两岸茶业学术研讨会论文集[C];2006年
10 侯渝嘉;何桥;李品武;梁国鲁;彭萍;邓敏;;川渝茶树种质资源遗传多态性ISSR分析[A];第四届海峡两岸茶业学术研讨会论文集[C];2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 徐荣燕;嗜热真菌糖苷酶的基因克隆、表达与分子改造[D];山东农业大学;2010年
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9 林建中;拟南芥4CL3基因在类黄酮合成代谢中的功能分析[D];湖南大学;2009年
10 高文瑞;鹰嘴豆耐旱种质的筛选、cDNA文库构建、EST数据分析及耐旱相关基因克隆[D];南京农业大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈水莲;深海细菌Exiguobacterium Oxidotolerans A011 β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达与酶学分析[D];华中农业大学;2010年
2 赵兴华;IL-6与GM-CSF基因融合表达生长抑素基因疫苗对小鼠生长的影响[D];华中农业大学;2010年
3 张东阳;黑粒小麦的分子细胞遗传学及抗氧化性研究[D];哈尔滨师范大学;2010年
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5 刘晓慧;山东黄茶叶加工工艺及品质研究[D];山东农业大学;2010年
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8 杨冬青;不同儿茶素含量茶树愈伤组织差异表达基因的cDNA—AFLP分析[D];安徽农业大学;2010年
9 孙美莲;茶儿茶素生物合成相关基因表达的实时荧光定量PCR分析[D];安徽农业大学;2010年
10 李学伟;西洋梨后熟和1-甲基环丙烯延缓后熟衰老机理的研究[D];新疆农业大学;2010年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 付月;薛永常;;木质素生物合成及其基因调控研究进展[J];安徽农业科学;2006年09期
2 王迎春;李春华;刘晓军;唐晓波;魏鹏;罗凡;王云;;茶叶中β-葡萄糖苷酶研究进展[J];安徽农业科学;2008年10期
3 田光辉;刘存芳;辜天琪;赵桦;;衰落桂花香气成分的GC-MS分析[J];安徽农业科学;2008年17期
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6 张秀云,方世辉,夏涛;乌龙茶萎凋做青中β-葡萄糖苷酶活性变化研究[J];安徽农业大学学报;2000年02期
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中国重要会议论文全文数据库 前1条
1 李叶云;芦原坦;;茶树咖啡碱生物合成相关基因表达研究[A];2008茶学青年科学家论坛论文集[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库 前8条
1 薛永常;杨树木质素合成酶PAL基因的克隆、鉴定及其表达载体的构建[D];中国林业科学研究院;2001年
2 黄建安;茶树分子遗传图谱构建及多酚氧化酶基因的SNP研究[D];湖南农业大学;2004年
3 刘雪梅;白桦木质素生物合成酶基因分离及遗传转化的研究[D];东北林业大学;2005年
4 汤文文;BRSK2对能量压力诱导下细胞周期适应性变化的调控作用研究[D];复旦大学;2006年
5 张广辉;茶树遗传转化及UV-B对香气相关基因表达影响的研究[D];浙江大学;2007年
6 张珣;六种植物病毒Real Time PCR定量方法的建立及其应用[D];中国农业科学院;2008年
7 胡轶;玉米木质素合成相关基因在干旱胁迫下的差异表达[D];四川农业大学;2008年
8 孙云;茶叶抗坏血酸过氧化物酶(APX)的生理学与分子生物学研究[D];福建农林大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张冉;α-法尼烯合成酶基因转化拟南芥和烟草的研究[D];山东农业大学;2011年
2 黄福平;乌龙茶(Camellia Sinensis L.)做青过程中生理生化的变化及其香气形成[D];福建农林大学;2001年
3 吕连梅;固定化酶技术改善绿茶饮料香气品质的研究[D];浙江大学;2004年
4 胡远辉;幼叶黄化油菜Cr3529抑制消减文库的构建和Toc33基因cDNA的克隆[D];四川大学;2004年
5 张晓萌;桃果实成熟过程中香气成分形成及其生理机制研究[D];浙江大学;2005年
6 何崚;茶树β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆及原核表达分析[D];安徽农业大学;2005年
7 卞伟华;桃树中β-半乳糖苷酶基因cDNA克隆和表达分析[D];安徽农业大学;2005年
8 郝炜;中国葡萄属野生种抗白粉病基因原核表达与抗体制备[D];西北农林科技大学;2005年
9 师竹娟;甘蓝型油菜木质素单体合成基因COMT和F5H的克隆及表达调控[D];中国农业科学院;2006年
10 周玲;乌龙茶香气挥发性成分及其感官性质分析[D];西南大学;2006年
【二级引证文献】
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1 汤雯;屠幼英;;利用加工方法提高夏秋茶品质研究进展[J];茶叶;2010年02期
2 邓婷婷;吴扬;李娟;李银花;黄建安;刘仲华;;茶树泛素活化酶基因全长cDNA克隆及序列分析[J];茶叶科学;2012年06期
3 吴颖;戴永峰;张凌云;;做青工艺对乌龙茶品质影响研究进展[J];广东茶业;2013年05期
4 陈萍;;里氏木霉β-葡萄糖苷酶的研究进展[J];海峡药学;2012年11期
5 文海涛;陈忠正;赵亮;郭健;李斌;蒋跃明;;南昆山毛叶茶cDNA文库构建[J];食品科学;2008年05期
6 王力;林智;吕海鹏;谭俊峰;郭丽;;茶叶香气影响因子的研究进展[J];食品科学;2010年15期
7 邵济波;唐茜;周晓兰;韩楠;谢文钢;;四川引种安吉白茶主要生化成分分析[J];食品科学;2012年16期
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中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 史成颖;茶树幼根EST文库构建及茶氨酸代谢相关基因表达分析[D];安徽农业大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前6条
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【二级参考文献】
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【相似文献】
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3 方圆;大棚茶树栽培要领[N];江苏农业科技报;2006年
4 通讯员 张泽文 苏俊峰;斩断茶园黑手[N];云南经济日报;2007年
5 本报记者 苗红梅;“英红”绽放背后的创新升腾[N];广东科技报;2011年
6 通讯员 叶茂;保靖2057株古茶被列为文物保护单位[N];团结报;2009年
7 梁丽记者 朱文达;山东省茶叶质检站科研项目通过鉴定[N];中国质量报;2008年
8 记者 江宇;周杰:14年守候一个国家级良种[N];雅安日报;2007年
9 李洁;浙江:拓展绿茶价值 白化茶成新宠[N];中国特产报;2009年
10 陈亚林;普纳山上出好茶[N];黔西南日报;2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王新超;茶树越冬芽休眠与萌发相关基因的分离与表达分析[D];中国农业科学院;2011年
2 黄建安;茶树分子遗传图谱构建及多酚氧化酶基因的SNP研究[D];湖南农业大学;2004年
3 王梦馨;叶蝉诱导的茶树重要防御相关基因的功能解析和互利素鉴定应用[D];南京农业大学;2012年
4 田亚玲;银杏和茶树复合经营系统生理生态效应研究[D];南京林业大学;2012年
5 娄伟平;浙江省大佛龙井产区春季茶叶霜冻灾害研究[D];南京信息工程大学;2013年
6 马建强;茶树高密度遗传图谱构建及重要性状QTL定位[D];中国农业科学院;2013年
7 郭春芳;水分胁迫下茶树的生理响应及其分子基础[D];福建农林大学;2008年
8 姚明哲;利用ISSR和EST-SSR标记研究中国茶树资源的遗传多样性和遗传结构[D];浙江大学;2009年
9 余梅;茶树花蕾发育相关基因的分离及表达研究[D];安徽农业大学;2007年
10 杜颖颖;新梢白化茶树品种白化机理研究[D];浙江大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈好;茶树品种资源检索数据库的构建[D];浙江大学;2011年
2 刘洋;山东茶树品种引进及种质资源调查研究[D];山东农业大学;2011年
3 金玟廷;德昂族管理和利用茶树的初步研究[D];中央民族大学;2012年
4 刘威;茶树炭疽病的病原鉴定及其遗传多样性分析[D];福建农林大学;2013年
5 蒋洵;湖南武陵山区优质绿茶生态条件评价和茶树品种适应性研究[D];中南大学;2011年
6 黄伟峰;竹醋液抗寒剂的研制及对茶树抗寒性影响的研究[D];中国计量学院;2012年
7 杨冠英;苍山山系茶树内生真菌的分离及其抑菌作用研究[D];大理学院;2012年
8 许雷;茶树多酚氧化酶的提取、分离纯化及其部分酶性质研究[D];华中农业大学;2014年
9 王磊;基于茶树基因组信息的SSR分子标记的筛选及其初步应用[D];安徽农业大学;2012年
10 刘祥琦;茶树咖啡碱合成途径中疑似N-甲基核苷水解酶的原核表达及活性验证[D];安徽农业大学;2013年
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