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《安徽农业大学》 2005年
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几种草坪草转基因及体细胞无性系变异的研究

张磊  
【摘要】:本试验以成熟种子为试材,优化了日本结缕草愈伤组织诱导及分化再生及农杆菌介导遗传转化的关键因子,在此基础上进行了 bt 基因转化日本结缕草的研究;在建立了高羊茅高效再生体系的基础上,将体细胞无性系变异技术与诱变技术相结合进行了高羊茅优质突变体的研究。结果如下: 1)以破除休眠的日本结缕草和高羊茅成熟种子为外植体,通过单因素和多因素试验确定了两种草坪草愈伤组织诱导、继代和分化的最佳培养基。结果表明,日本结缕草愈伤组织的诱导培养基为含 2,4-D 1 mg/L+NAA 3mg/L 的 MS 培养基;继代培养基为含2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 0.2 mg/L 的 MS 培养基;分化培养基为含 6-BA 3 mg/L+KT 3.5mg/L 的 MS 培养基;生根培养基为含 NAA 0.3mg/L 的 MS 培养基。高羊茅愈伤组织的诱导培养基为含 2,4-D 5 mg/L+6-BA 0.2 mg/L 的 MS 培养基;分化培养基为含 6-BA 3mg/L 的 MS 培养基;生根培养基为不含激素的 1/2MS 培养基。以上所有固体培养基中均添加 30g/L 的蔗糖和 3g/L 的 phytagel。 2)将获得的胚性愈伤组织进行γ辐照处理,经再生后获得了一批日本结缕草和高羊茅的叶形、叶色、株高等突变体。对其中的黄叶高羊茅种子后代进行空间技术处理。结果表明,空间技术引起的 SP1生理损伤较轻,SP2未发现叶绿体缺失突变,但株叶形态、熟期和耐热性变异丰富,从中筛选、鉴定了半矮秆、匍匐性、细叶、迟熟、耐热性等优质抗逆黄叶高羊茅突变体。 3)以 gus 基因瞬时表达为指标,对农杆菌介导日本结缕草成熟种子诱导的愈伤组织转化体系及其影响因子进行了系统性研究。结果表明,获得最佳转化效率的条件为:取继代培养 2 周的胚性愈伤组织于添加 100μmol/L AS 的培养基上预培养 3-5d;感染前24h 进行 2Gy 辐照处理,再接种于预培养基上; OD600 值为 0.2 的菌液感染 5min,于注射器中抽拉 20 次;感染后于光照或 16h 光照、22℃条件下共培养 3d;选择培养间隔以 7-10d 为宜。研究了不同抗生素的抑菌效果和日本结缕草愈伤组织的本底耐受性。结果表明,250-500mg/L 的羧苄青霉素可以较好地抑制农杆菌的生长。日本结缕草对潮霉素比卡那霉素更敏感,将愈伤组织接种于含潮霉素 200mg/L 的诱导培养基上,两周后愈伤组织褐化死亡率超过 90%。
【学位授予单位】:安徽农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:S688.4

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