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一些重要斑痣盘菌的分类、培养及RAPD分析

何宇峰  
【摘要】:本论文从形态解剖、个体发育、生态、地理分布等特征对斑痣盘菌科中 7 个属的重要成员一些种进行较系统的分类研究,同时对齿裂菌属、皮下盘菌属以及斑痣盘菌属的重要种进行种内和近似种间的 RAPD 分析。 以 Darker(1967)和 Cannon Minter(1986)等人提出的分类观点为主要依据,对采自皖南山区、合肥地区和保存于安徽农业大学森保教研室(AAUFP)共 200 余号标本进行鉴定、分离培养、分类。共查明隶属于散斑壳属(Lophodermium)、舟皮盘菌属(Ploioderma)、皮下盘菌属(Hypoderma)、小鞋孢盘菌属(Soleella)、小双梭孢盘菌属(Bifusella)、斑痣盘菌属(Rhytisma)和符氏盘菌属(Vladracula)7 属的11 个种,除已知的 9 个种外,还包括 2 个新种:八角生散斑壳(L. illiciicola)和山桂花散斑壳(L. osmanthi)。对其编制了二叉式分种检索表,对各种均提供了形态解剖学特征的描述与图解以及寄主、生境和世界分布的记录,并加以讨论。 利用组织分离法对采自安徽黄山风景区及合肥地区的部分活斑痣盘菌材料在MA 培养基上进行分离培养,获得 18 个分离株,涉及皮下盘菌属(Hypoderma)、齿裂菌属(Coccomyces)、斑痣盘菌属(Rhytisma)和符氏盘菌属(Vladracula)4 属 13种,其中包括皮下盘菌属的 2 个未知种。不同属的各菌培养性状存在显著不同,同属的不同种也有较大差别,甚至同种的不同分离株在生长速度、菌落颜色、大小以及成熟期等方面均有差异。培养期间各菌株定期进行观察描述,少数产生分生孢子器及线(环)纹,但均不产生子囊果。 对 15 个皮下盘菌属(Hypoderma)不同分离株、10 个齿裂菌属(Coccomyces)不同分离株以及 2 个斑痣盘菌属(Rhytisma)不同种分离株以及近似种环纹符氏盘菌(Vladracula annuliformis)分离株进行了 DNA 提取、PCR 扩增体系的优化以及种内和近似种间的 RAPD 分析。RAPD 技术具有引物没有严格的种属界限、多态性强及检测灵敏等特点,但 RAPD 技术的稳定性和重复性差,因此,有必要寻找一个适合本试验的 RAPD 反应体系,提高其稳定性和可重复性。本论文分别测试了模板 DNA 浓度、dNTPs 浓度、Mg2+浓度、引物浓度、Taq DNA 聚合酶浓度以及退火温度和时间、延伸时间、循环次数等对 RAPD 反应结果的影响。结果表明:10×PCR buffer、2.0mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTPs、0.3μmol/L 随机引物、100ng/μl DNA 模板和 1U Taq 酶为最佳反应浓度;95℃预变性 5 min、94℃变性 1min、36℃退火 80s、72℃延伸 2min20sec、72℃延伸 10min、扩增 50 个循环为最佳反应程序。 从 100 个随机引物中筛选出 15 个引物对 15 个皮下盘菌属(Hypoderma)不同分离株进行 RAPD 分析,共扩增出 136 个位点,多态性位点数为 134 个,占 98.5%。其中随机引物 S96 扩增出的条带数最多为 13 个,扩增出的条带数最少的是引物 S11 和


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