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猕猴桃种质资源RAPD分析及芽变SCAR标记研究

贾兵  
【摘要】:猕猴桃属植物种类繁多,全世界有 66 个种,约 118 个种下分类单位(变种、变型),其栽培品种也较多,主要是中华猕猴桃和美味猕猴桃。猕猴桃为多年生藤本果树,生长周期长,用常规方法进行遗传基础研究,效率不高;由于地理分布的重叠和种类间的自然杂交,产生了多种中间过渡类型,使其种间和种内品种的界线并不十分清晰,增加了猕猴桃遗传变异研究的难度。 本文以猕猴桃 10 个种、34 个栽培品种共 42 个生物型的叶片为试验材料,采用改良 CTAB 法提取基因组 DNA,对猕猴桃各生物型遗传变异进行研究。试验对 RAPD反应中的 Taq 酶浓度、模板 DNA 浓度、Mg~(2+)浓度、dNTPs 浓度及随机引物浓度进行了逐个优化,建立了猕猴桃基因组 RAPD 分析的最佳反应体系。即总反应体积 20 μL,Taq 酶 1.0 U 、模板 DNA 80 ng、MgCl_2 1.25 mmol·L~(-1)、dNTPs 0.25 mmol·L~(-1),引物 1.0 ng·μL~(-1)。PCR 热循环参数为 94℃预变性 5 min;94℃变性 1 min,37℃退火 1min,72℃延伸 2 min,循环 40 次;最后在 72℃延伸 6 min。 试验从 80 个随机引物中筛选出了扩增结果稳定、谱带清晰的引物 38 个,进行PCR 扩增,扩增结果经 0-1 编码后,采用欧氏距离平方系数和组间连接法,应用 SPSS11.0 for Windows 软件进行聚类分析。 聚类分析结果显示,中华猕猴桃“武植 2 号”和美味猕猴桃“哑特”在距离系数为 46.0 时聚为一类,说明美味猕猴桃和中华猕猴桃亲缘关系较近;美味猕猴桃品种“米良 1 号”、“青城 1 号”和绝大多数中华猕猴桃品种聚类距离系数为 96.4,所有的美味猕猴桃和中华猕猴桃品种聚类距离系数为 104.5,且聚类的先后秩序有交叉现象。因此,根据 RAPD 分析结果,认为将这两个种归为同一个种更为合理;“川猕 1 号”和“川猕 2 号”、“徐香”和“徐冠”、“华美 1 号”和“华美 2 号”、“武植 2 号”和“武植 3 号”都分别在较近的距离水平上聚在一起,说明猕猴桃品种之间确有按原产地聚类的趋势。 根据猕猴桃基因组 DNA 的 RAPD 分析,构建了特异带 DNA 指纹图谱,利用这一图谱,可将猕猴桃 42 个生物型中的 12 个生物型区别开来。 “皖翠”是 1993 年发现的“海沃德”自然芽变新品种,由安徽农业大学园艺学院选育。本试验研究发现,“海沃德”与“皖翠”在 38 个随机引物扩增中,有 14 个引物出现了 18 条特异带,说明“皖翠”在 DNA 水平上呈现了较大范围的的变异。 从“海沃德”与“皖翠”的 18 条特异带中,选择了两条分子量分别为 740 bp、649 bp 的特异带,进行了分离、纯化、克隆与测序,根据测序结果设计出 4 条 20 bp的特异引物,再进行 SCAR-PCR 扩增。


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