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《安徽农业大学》 2006年
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交链孢菌基因p42A的原核表达、纯化及生物信息学分析

吕素芳  
【摘要】: 本文以cDNA文库筛选到的p42A基因为材料,构建原核表达载体,并进行目的蛋白的表达和纯化,同时对p42A基因及其编码的蛋白质进行生物信息学分析,为从结构和分子水平进一步研究激活蛋白及其作用机理奠定基础。结论如下: 1.利用分子生物学方法,采用通用ITS引物成功地克隆了一株真菌的ITS区段,经与Gene Bank所有序列进行Blast,结果与链格孢属Alternaria spp.的ITS区段完全相同。 2.通过聚合酶链式反应(PCR),扩增出含酶切位点的p42A基因片段,并将该基因按正确阅读框分别克隆到融合表达载体pGEX-KG及非融合表达载体pBV221上,经鉴定证明,融合及非融合表达载体均构建成功且获得表达。对融合表达和非融合表达情况进行比较发现,前者表达量较高,而后者表达量很低。 3.对融合表达的质粒进行培养,建立菌液生长曲线,通过菌液密度、诱导剂浓度、诱导时间和温度等条件的摸索,获得融合蛋白的最佳表达条件。结果表明,最佳诱导时间为培养后4h;诱导剂IPTG的最佳浓度为1.0mmol/L;37℃下诱导培养4h时产物表达量最高。通过超声波破碎菌体细胞,离心及电泳发现,表达产物为可溶性蛋白。 4.对表达的融合蛋白进行“两步法”纯化:先通过亲和层析柱纯化获得融合蛋白,利用凝血酶切割除去GST标签,再通过亲和层析柱纯化获得目的蛋白。对融合蛋白利用Western Blot进行特异性鉴定,进一步确定了杂交带即为连接了GST标签的融合蛋白带。 5.采用P42A蛋白液浸泡小麦种子后,对小麦生长初期体内抗氧化酶活性和丙二醛含量进行测定。结果处理的小麦SOD活性和POD活性高于对照;小麦体内MDA含量基本上均低于对照。说明作为激活蛋白的辅助蛋白—P42A蛋白液浸泡小麦种子后,可以增强小麦体内抗氧化能力,并能显著提高小麦幼苗的抗性。 6.采用多种方法进行生物信息学分析,p42A基因编码蛋白质的搜索结果显示,该蛋白与TCTP蛋白家族序列相似性程度很高,达61.0%。二级结构预测结果表明,该蛋白质随机卷曲含量丰富,达46.15%。对P42A蛋白进行模体搜索表明为单结构域蛋白,通过同源模建获得了P42A蛋白的三级结构。
【学位授予单位】:安徽农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:Q78

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