海洋镰孢霉岩藻多糖酶的制备、酶学性质及表征

【摘要】： 岩藻多糖是褐藻中所特有的杂多糖,它属于异多聚碳水化合物,具有生理功能,特别是低分子量岩藻多糖具有很强的生物学活性,其活性与其分子结构和分子量大有关,分子量在8,000～100,000范围内有明显的生理作用,低分子量岩藻多糖生理功能主要表现在抗凝血和抗血栓作用,此外还具有抗肿瘤、消炎等作用。岩藻多糖酶可部分降解岩藻多糖得到低分子量组分。因此,对岩藻多糖酶的研究具有十分重要的意义。 本实验以海洋真菌LD-8为出发菌株,通过菌种的复壮,固态发酵,制备出岩藻多糖酶发酵液,经丙酮沉淀及Sephadex G-100层析后提纯倍数为22.7,收率为23.9%。纯化后的岩藻多糖酶,在聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳、等电聚焦电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳均显示一条单一的色带,证明其组分单一。得其等电点为4.5,分子量为64,000道尔顿。酶学特性研究结果表明:LD8菌产岩藻多糖酶最佳时间为48h,酶的最适反应温度为60℃;将酶液分别放置于不同温度下保温1h后,半失活温度为38℃;最适反应pH为6.0;在pH为6.0的条件下酶有较佳的稳定性。不同金属离子与岩藻多糖酶作用1h时,Cu~(2+)、Co~(2+)、Ni~(2+)、Fe~(2+)对酶有一定的激活作用,Ca~(2+)、Zn~(2+)略有抑制作用。 本实验首次采用了傅立叶红外变换光谱(FT-IR)对岩藻多糖酶的二级结构进行分析测定。然后用Peakfit4.12软件对包含二级结构信息的谱峰进行拟合分析。为保证结果的可靠性,分别在酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅲ带进行拟合。FT-IR结果显示:天然岩藻多糖酶的二级结构以β-折叠的含量占优势,β-转角和无规卷曲次之,α-螺旋含量相对较少;酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅲ带的拟合结果吻合,说明所获得的数据是可靠的。通过不同温度下岩藻多糖酶酰胺Ⅰ带红外拟合图以及二级结构的变化趋势,研究了温度对二级结构的影响。当温度低于60℃时,酰胺Ⅰ带α-螺旋百分含量呈上升趋势,而β-转角所占比重呈下降,温度升高到60℃以上时,酰胺Ⅰ带二级结构各百分比含量基本保持不变,推断出岩藻多糖酶的热变性温度为60℃～70℃之间。随着温度的变化,β-折叠与无规卷曲含量的变化无明显规律。 通过荧光光谱的扫描,得出岩藻多糖酶是含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的B类球蛋白。并比较了不同pH下普通荧光光谱和同步荧光光谱的变化情况:岩藻多糖酶的荧光强度的变化以pH 6.0时作为明显界限,在pH＜6.0和pH＞6.0的范围内,随着体系酸性或碱性的增加,荧光强度均逐渐消弱。当△λ=60nm时,酸性及中性条件下,荧光信号较弱,当△λ=20nm时,与中性环境相比我们发现,酸性和碱性环境中的岩藻多糖酶的荧光强度较弱。 紫外差示光谱提供的信息与酶学性质研究时所得数据遥相呼应,Ca~(2+)、Zn~(2+)与岩藻多糖酶结合后,抑制了酶的活力,同时在差示光谱中发现α-螺旋相对应的波长范围内都出现了负峰,即α-螺旋含量降低了;岩藻多糖酶分别与Co~(2+)、Fe~(2+)和Cu~(2+)结合后,酶活性都受到了一定程度的激活,紫外差示光谱则表现出了相应的正峰,即α-螺旋含量有所增加。上述实验表明,α-螺旋结构是该酶发挥催化功能所必需的。酶分子与EDTA结合后,光谱也呈现出正峰现象。这些数据揭示了岩藻多糖酶分子中不仅可能含有金属,且当酶与金属离子结合时使酶的构象发生了改变,导致酶活力的了变化。

【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R284