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《安徽农业大学》 2007年
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细极链格孢蛋白激发子的纯化、基因克隆与功能分析

赵明治  
【摘要】: 本文研究了从细极链格孢中分离纯化的一种促进植物生长和诱导植物抗病性的蛋白质激发子;获得了该基因的全序列;构建了该基因的原核表达载体并表达纯化了该蛋白;该研究为进一步探讨植物蛋白激发子及其作用机理奠定了理论基础,结果如下。 1.建立了细极链格孢蛋白激发子纯化的技术体系 细极链格孢在PD培养基中培养后抽滤获得菌饼后,用Tris-HCl缓冲液提取总蛋白。用硫酸铵沉淀法和酒精沉淀法从细极链格孢菌丝中获得了蛋白激发子粗制品。筛选并确定了纯化蛋白样品的缓冲液,利用DEAE离子交换层析技术,通过梯度洗脱获得目的蛋白峰;进一步用Superdex75 10/300凝胶过滤层析对目的蛋白峰进行纯化,获得了银染电泳纯的单一条带;利用固相梯度凝胶电泳技术,测定该蛋白的等电点为4.22。 2.利用斑点固相亲和层析技术获得了特异性很高的多克隆抗体 采用斑点固相亲和层析技术从制备的粗抗体中纯化了特异性很高的多克隆抗体,纯化抗体浓度与粗抗体稀释100倍的浓度相当。 3.蛋白激发子的基因克隆 根据MALDI-TOF、MALDI-TOF/TOF、microLG-ESI,nanoLC-ESI-IT-MS/MS技术确认的肽段序列:1.LFVINKPDVYKSPSSNTWIIFGEAK,2.DIELVMQQASVSR3.ALKENDNDIVNSIMALSI,4.RPKNILFVINQPDVYK设计兼并引物,以细极链格孢cDNA模板,进行RT-PER,经过多次实验获得该蛋白的一段基因序列,其中较长的序列共有373个碱基。利用3'RACE和5'RACE的方法分别获得基因的3'和5'序列,将获得的基因片段拼接得到了该蛋白完整的编码区即最大的开放阅读框ORF,该基因编码一个207个氨基酸的蛋白,这个蛋白的理论分子量为MW=22.3590KD,理论等电点为4.43,该基因已在GenBank的登陆,登陆号为CH445335。 以细极链格孢基因组DNA为模板,进行扩增,获得含有内含子的基因序列。将获得的该基因的cDNA序列与该基因的基因组序列进行比较发现,DNA序列在237~350、409~513碱基间插入了两段内含子序列。 4.蛋白激发子的重组表达、纯化与活性测定 将该基因分别与pET-28a和pGEX-6P-1载体连接,构建原核表达载体。利用IPTG进行化学诱导并筛选最佳表达条件,使蛋白得到高效表达;对含有表达载体的大肠杆菌总蛋白进行电泳和Western-Blot分析表明,外源基因获得高效表达,并且重组蛋白与纯化的多克隆抗体产生免疫沉淀反应;利用chelating预装柱进行纯化,以BindingBuffer+4%Elution Buffer进行上样,以100%Elution Buffer进行洗脱,获得纯度较高的表达蛋白;将表达蛋白煮沸20min,没有明显改变蛋白的溶解度,说明重组表达蛋白是一种热稳定蛋白。质谱测定结果显示,重组蛋白与理论蛋白分子量相同,与纯化蛋白具有相同的肽指纹图谱。通过比较重组蛋白与纯化蛋白的SDS-PAGE和质谱测定获得的精确分子量证明,该蛋白具有非正常电泳迁移率的特征。生物活性测定表明重组蛋白与分离纯化的蛋白都具有明显提高小麦根系活力和琥珀酸脱氢酶活性的活性。
【学位授予单位】:安徽农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S182

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【参考文献】
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