葛内生真菌次生代谢产物清除自由基活性的研究

【摘要】： 本文采用DPPH自由基酶标仪检测方法对葛内生真菌(endophytic fungnnus)次生代谢产物进行了清除自由基活性的筛选。发现一株采集于安徽宣城马姑山的野葛叶中分离出的菌株10y-4具有较强的清除自由基活性,并以该菌株次生代谢产物的自由基清除率为指标,进行了培养条件和活性物质提取工艺的研究。具体主要内容包括:葛内生真菌的采集、培养与分离,活性菌株的筛选,营养性因素和非营养性因素对10y-4菌株次生代谢产物清除自由基活性影响的研究,活性组分的分离提取工艺和分离纯化,活性化合物的纯度鉴定与分析。 药用植物葛采集于安徽黄山、宣城、泾县和合肥,从葛的根、茎、叶以及果实中共分离出128株内生真菌,其中从叶中分离出49株(占总分离菌株的38.3%),从茎中分离出35株(占总分离菌株的27.3%),根中分离出40株(占总分离菌株的31.3%),果实中分离出4株(占总分离菌株的3.1%)。 采用酶标仪法对128株内生真菌的液体发酵培养物进行了初筛,其中菌株HK-19(茎,宣城)、HK-53(叶,黄山)、HK-96(叶,合肥)、4g-6(根,黄山)、10y-4(叶,宣城)自由基清除率都在70%以上,对这些活性较高的菌株进行复筛,结果发现菌株10y-4的活性最高,在浓度2.5mg/ml反应时间为20min时,其自由基清除率达到92.3%。 通过液体培养基组成成分的正交试验,以自由基清除率为指标,比较不同的营养性因素包括碳氮源、无机盐及不同的非营养因素包括pH、温度和培养时间对清除自由基活性的影响。试验结果表明:菌株10y-4的最佳碳源是葡萄糖和麦芽糖组成的复合碳源,该复合碳源对菌株的清除自由基活性具有明显的促进作用,菌株10y-4的最佳氮源为蚕蛹粉。结合无机盐和生长因子的影响,最终得到最适液体培养基的组成为:即葡萄糖10g·L~(-1)、麦芽糖10 g·L~(-1)、蚕蛹粉20 g·L~(-1)、MgSO_4·7H_2O0.4 g·L~(-1)、柠檬酸铵0.4 g·L~(-1)、V_B 0.2 g·L~(-1)。 试验研究了非营养性因素中的pH值、接种量、发酵温度和培养时间对菌株10y-4清除自由基活性的影响,结果表明:100ml摇瓶中装40ml液体培养基,在pH值为6.5,接种量为5%,生长温度为25℃,培养时间为10d时有利于清除自由基活性的提高。 在原始培养基的基础上添加了葛根煎汁培养液,结果发现在相同的情况下可以促进内生真菌的产生,提高内生真菌的分离效率。 通过比较不同提取方法的处理及相关理化试验,确立了活性物质的最佳提取工艺为:发酵液50℃浓缩至原体积的1/5,加入3倍体积95%乙醇(乙醇终浓度为75%)醇沉两次,弃沉淀并脱醇后,以正丁醇为萃取试剂,按2:1的体积比分三次萃取,取正丁醇相,浓缩至干,即得到活性物质的粗提品。 本试验采用高效液相色谱法分析粗提物,同时收集流分进行活性测定,进而确定活性组分的大致部位,再经高效液相制备柱多次制备及合并组分最终获得了一个化合物G-1,运用高效液相法(HPLC)和薄层层析法(TLC)对该化合物进行纯度鉴定并分析。高分辨质谱和紫外光谱分析及数据库检索发现该化合物是3-(2,4-二羟戊基)-6,8-二羟异香豆素,分子量为280,分子式为C_(14)H_(16)O_6,为黄色粉末状。