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《安徽农业大学》 2009年
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采后苹果与炭疽菌的相互作用及病害控制机理研究

檀根甲  
【摘要】: 果实采后腐烂是一个全球性问题,已引起世界范围的极大关注。苹果炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides)是苹果上的主要病害,引致苹果采后腐烂严重。本文从从保护生态环境和农业可持续发展的角度出发,以苹果采后炭疽病为研究对象,利用物理的、化学的、生物的和农业的无污染防除技术及分子鉴定诊断技术,逐步组建苹果采后炭疽病可持续控制的病害防御体系。分别开展了苹果炭疽菌生物学特性研究,利用离子束生物工程和磁生物工程技术诱变的枯草芽孢杆菌和苹果炭疽菌低毒性菌株防治苹果采后炭疽病的控病效果和作用机制研究,与环境相容好、高效、低毒、使用安全、对仓储苹果无污染,不影响外观和风味的新农药、新剂型和使用技术研究,品种抗病性鉴定及不同苹果品种对炭疽病菌的抗性生理生化机制和苹果炭疽菌致病机制研究,苹果炭疽菌的快速分子鉴定和检测及苹果炭疽病的早期诊断。主要研究结果如下: 1.苹果炭疽菌生物学特性研究结果表明,苹果采后炭疽菌营养生长的温度范围为10℃~35℃,最适温为28℃。菌丝致死温度为40℃5d,分生孢子在40℃下培养11天后,仍具有萌发能力。分生孢子萌发以25℃最佳,芽管伸长以30℃最适。液体培养,30℃时菌丝生长量最大。RH<80%时菌丝不能生长,RH>80%时菌丝生长速率差异不大。分生孢子的萌发对湿度要求严格,仅在自由水和有水膜的情况下萌发。pH为3~11范围内均可营养生长,pH 2~11范围内孢子均可萌发。液体培养条件下,适合营养生长的pH范围为4~9,且在此范围差异不明显。在一定范围内,酸性条件下孢子萌发率较碱性条件下萌发率高。在一定温、湿度条件下,苹果贮藏过程中炭疽病的发展曲线为不对称S型,用冈珀茨模型(Gompertzmodel)进行曲线拟合,模型拟合度达到极显著水平。 2.苹果炭疽菌的分子鉴定和检测结果表明,两株病原菌Cg-1和Cg-2的ITS序列相似性达100%;二者与胶孢炭疽菌的相似性极高,达99.8%;与炭疽菌其它7个种的相似性相对较低,只有83.1%—98.5%;与不同属的镰刀菌相似性最低,为68.9%。因此可以明确苹果炭疽菌应属于胶孢炭疽菌。经序列比对发现,苹果炭疽菌的18S rDNA 3'端比GenBank已登陆的2个胶孢炭疽菌多出一段379 bp的序列,将去除379 bp的苹果炭疽菌rDNA序列与其它胶孢炭疽菌相比,序列相似性高达96.6%。根据这一特有片段设计特异性引物,结果仅能从苹果炭疽菌中扩增出1232 bp的特异性条带。用苹果炭疽菌接种离体苹果,以接种发病的病组织总DNA为模板,利用引物CgF1/ITS4进行PCR扩增,同样可以扩增出1232 bp的特异性条带,而健康苹果组织DNA中未能扩增出任何条带,表明该方法可用于苹果炭疽菌的鉴定和快速检测。 3.苹果采后炭疽病的化学防治及控病机理研究结果表明,丙环唑、苯氧菌酯、扑海因、苯醚甲环唑和氟硅唑抑菌作用较强,代森锰锌抑菌作用较弱。药剂间对孢子萌发率和芽管伸长抑制率差异显著,其中扑海因、氟硅唑对孢子萌发有抑制作用,抑制率分别为42.6%、48.3%。代森锰锌、丙环唑几乎无抑制孢子萌发的作用,孢子萌发率为99.3%、98.2%。但丙环唑对芽管伸长能较好的抑制。活体试验表明:丙环唑、苯氧菌酯、嘧菌酯防效较好,其中丙环唑的防效达到100%。药剂不同作用方式的试验结果说明:浸果处理明显好于喷雾。混剂以多菌灵+代森锰锌(9∶1,7∶3)抑菌效果为最好,抑制菌丝生长的共毒系数达到692.426、593.020。活体试验表明:混剂以多菌灵+代森锰锌(9∶1、7∶3)防效为最好。 4.钙盐对苹果炭疽病菌的抑制作用结果表明,CaCl_2、Ca(NO_3)_2·4H_2O和Ca(H_2PO_4)_2对菌丝生长有一定的影响。Ca~(2+)浓度为900μg/ml时,对菌丝生长影响较小,Ca~(2+)浓度高于1000μg/ml时能较好地抑制菌丝生长,Ca~(2+)浓度低于600μg/ml时有促进菌丝生长的趋势。CaC_(l2)、Ca(NO_3)_2·4H_2O和Ca(H_2PO_4)_2不能抑制分生孢子的萌发。钙盐对芽管伸长的抑制作用,当Ca~(2+)浓度大于900μg/ml时Ca(NO_3)_2·4H_2O、CaCl_2和Ca(H_2PO_4)_2的抑制率分别为13.10%、45.75%和46.09%;当浓度继续增大时,浓度处理之间的抑制作用差异不显著。当浓度小于600μg/ml时,对芽管的伸长反而有一定的促进作用。 5.苹果采后炭疽病生物防治及控病机理的研究结果表明,利用低能氮离子对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进行注入诱变,通过平板初筛出6株对苹果炭疽病菌有较好抑菌作用的菌株,经苹果果实活体测定从中筛选对苹果炭疽病有较好控病作用的菌株,从接种方式及病害发生的时间看,先接突变菌株的各处理发病时间均晚于先接病菌的处理,明显推迟发病时间,表现出较强的保护作用,低温储藏对病害发生的抑制作用更明显。以先接突变菌株后控病效果较好的菌株按储藏温度的不同分为:室温下的防治效果较好的菌株为BS80-6,14d时的防效为33.28%;低温条件下BS100-1、BS100-6、BS80-6、BS120-8的效果较好,30d时的防效分别为98.36%、95.36%、95.52%、93.52%;变温下各菌株BS80-1、BS100-1、BS120-8的效果最好,30d的防效分别为84.59%、75.15%、72.40%。突变菌株三种处理液对病菌孢子萌发抑制作用以活菌液的效果最好,其次是滤液,高压灭菌液的效果最差。经平板滤纸片法和液体共培养法测定突变菌株对病菌菌丝的破坏作用的显微镜观察结果表明,BS80-6菌株产生的抗生物质抑制孢子萌发、使苹果炭疽病菌菌丝体畸形,原生质凝集,泡囊化。同时对寄主防御酶(POD、PPO、PAL)活性的研究表明突变菌株能诱导寄主产生抗病性。 6.热处理与药剂相结合、枯草芽孢杆菌滤液分别与Ca~(2+)和苯氧菌酯配合使用的抑菌作用结果表明,热处理与药剂结合则能更好地控制病害,丙环唑和禾纹清在40℃作用下的效果最好,药剂与热处理相结合的防效大于药剂单独作用的防效。枯草芽孢杆菌的滤液分别与Ca~(2+)和苯氧菌酯配合使用的抑菌效果明显好于单独使用Ca~(2+)和苯氧菌酯配的效果。其中滤液与苯氧菌酯的配合使用的效果最佳,对苹果炭疽病菌的抑制效果达到58.2%。滤液与Ca~(2+)混合使用抑制率达到32.9%,比单独使用Ca~(2+)的抑制效果提高了27.8%。滤液和Ca~(2+)、苯氧菌酯结合使用在苹果果实上的控制效果明显好于单独使用Ca~(2+)、苯氧菌酯的效果。滤液与Ca~(2+)结合控制效果提高了11.7%。 7.苹果炭疽菌低毒性菌株筛选及控病作用的研究结果表明,离子注入C100-2-5低毒株和磁场处理C0.25-1-2低毒株对苹果有较好的保护作用。离子诱变的低毒性菌株对苹果炭疽病的控制效果达到55%左右。低毒性与强毒性菌株按不同比例混合接种苹果的控制效果之间的差异显著性不明显,但都与单接种的强毒菌株达到显著差异。菌株的毒性不同,引起果实体内酶的活性变化也略有不同。测定低毒菌株rDNA序列,结果表明,引物CgF/CgR均可以扩增出3156 bp的片段,且此段序列几乎没有发生变异。30条随机引物进行RAPD扩增,结果表明低毒菌株与正常菌株RAPD扩增多态性无明显区别,未能发现差异性,ISSR扩增结果表明低毒菌株与正常菌株无明显区别,20条引物未能发现差异性。 8.采后苹果与炭疽菌相互作用及生理机制研究结果表明,苹果对炭疽菌抗性品种间差异极显著(P=0.01),根据发病程度,其抗性可以分为四类:红富士感病(S);嘎啦、乔纳金次之,中感(MS);辽伏中抗(MR);黄金帅果实发生过敏性坏死反应,抗病(R)。初步明确了聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)和羧甲基纤维素酶(Cx)在该菌侵染苹果过程中起关键作用。苹果果实接种炭疽菌后β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性都被诱导提高,几丁质酶活性增幅高于β-1,3-葡聚糖酶,分别是对照的3-11倍和2-6倍。苹果感染炭疽菌后,主要防御酶过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性变化与品种抗性有明显相关性,表现出相似的趋势,抗病品种酶活始终高于感病和中感品种,接种前差异不显著,接种后差异显著,抗病品种酶活性升高幅度大,高峰出现的早,且一直保持在较高的水平。接种前,与品种病情指数呈正相关的生化因子是健康果实可溶性总糖含量,负相关的生化因子是健康果实木质素含量和绿原酸含量,其相关系数都在0.99以上,健康果实总酸含量与品种病情指数无关。
【学位授予单位】:安徽农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S436.611.1

【引证文献】
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3 王高峰 邢辉 周荣;林果病虫害生物防治[N];周口日报;2008年
4 ;荷兰Koppert新型生物防治产品上市[N];中国花卉报;2009年
5 记者 曹湘黔;不用农药杀虫环保又经济[N];自贡日报;2010年
6 彭燮;百万“大军”的绿色战役[N];中国质量报;2008年
7 通讯员 杜东贵;幸福城农场棉田生物防治“三虫”效果好[N];兵团日报(汉);2009年
8 本报记者 王东生;赤眼蜂京郊农区“上岗”[N];农民日报;2009年
9 刘宪亮 耿雅雯;卤水点豆腐 天敌治害虫[N];东营日报;2008年
10 孔祥钦;生物防治天地宽[N];山东科技报;2001年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 檀根甲;采后苹果与炭疽菌的相互作用及病害控制机理研究[D];安徽农业大学;2009年
2 王志娟;木材变色菌的生物学特性及其防治[D];中国林业科学研究院;2005年
3 耿金虎;我国主要应用赤眼蜂种的若干应用基础研究[D];中国农业大学;2005年
4 吴兴泉;福建马铃薯病毒的分子鉴定与检测技术[D];福建农林大学;2002年
5 周洪友;荧光假单胞菌2P24抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚生物合成的基因调控研究[D];中国农业大学;2005年
6 李志岗;转基因小麦抗穗发芽特性的分子鉴定、遗传分析与抗性机理研究[D];山西农业大学;2004年
7 韩继刚;一株新的水稻植物内生固氮细菌Delftia tsuruhatensis HR4的鉴定及其生物学特性[D];首都师范大学;2004年
8 林晓民;大型真菌的生态多样性及分子鉴定[D];西北农林科技大学;2004年
9 韦传宝;一个侵染浙贝母的马铃薯Y病毒属新成员——浙贝母花叶病毒的鉴定[D];浙江大学;2005年
10 胡加付;农田林网中大斑啄木鸟对光肩星天牛控制作用的研究[D];北京林业大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 贾峰勇;沙棘木蠹蛾环境协调性控制技术的初步研究[D];北京林业大学;2004年
2 江晶;苹果炭疽菌分子鉴定和检测及其致病性分子变异初步研究[D];安徽农业大学;2008年
3 王敏霞;嘧磺隆防治紫茎泽兰的效果及其对泽兰实蝇体内解毒酶的影响[D];福建农林大学;2009年
4 王同伟;山东省东亚飞蝗发生影响因素及治理新技术[D];中国农业大学;2005年
5 李春光;除草微生物禾长蠕孢菌种诱变改良及分子鉴定[D];中国农业科学院;2006年
6 沈爱华;黄瓜苗期猝倒病的生物防治及病原拮抗细菌的分子鉴定[D];浙江大学;2003年
7 温广月;大豆根腐病生防细菌的筛选及作用机制研究[D];东北农业大学;2005年
8 严占勇;生防芽孢菌对辣椒疫病的控病及机理研究[D];西南农业大学;2005年
9 林珠凤;淡足侧沟茧蜂Microplitis pallidipes生物学及其利用的初步研究[D];华南热带农业大学;2006年
10 赵航;微生物除草剂菌种的原生质体融合研究[D];中国农业科学院;2005年
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