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《安徽农业大学》 2009年
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应用RNAi技术对球孢白僵菌羧基转运蛋白基因BbJEN1的初步研究

陈珊珊  
【摘要】: 羧基转运蛋白基因是近年来分离出的新基因,在虫生真菌中,它既与穿透昆虫体壁所需的能量有关,也受昆虫体壁的诱导,因此推测是一种重要的毒力因子,但确切功能尚需确定。本研究运用RNA干扰的方法,通过将球孢白僵菌羧基转运蛋白基因BbJEN1沉默来初步研究其功能。 实验构建了两种干扰载体:①PRNAi:根据基因库上的BbJEN1mRNA序列,设计并合成两端含有酶切位点的64个碱基的寡核苷酸链。寡核苷酸链退火后用T4DNA连接酶连接到线性化的pRNA-U6.1-Hygro质粒中,转化大肠杆菌,并对重组质粒进行菌落PCR及测序鉴定。②pbarGPE1-RNAi:根据GenBank中的BbJEN1基因组DNA序列设计两对分别含有特定酶切位点的特异引物,以球孢白僵菌基因组DNA为模板扩增目的基因片段。将正反向目的片段插入pbarGPE1质粒中,转化大肠杆菌,对重组质粒进行菌落PCR扩增及测序鉴定。干扰载体构建成功后,通过对分生孢子的抑制性实验,筛选出潮霉素B对球孢白僵菌的最佳抑制浓度为600μg /mL。采用原生质体转化和芽生孢子转化两种方法转化球孢白僵菌,均获得转化子。其中芽生孢子转化法获得的转化子为7个/μgDNA,原生质体转化法获得的转化子为0.9个/μgDNA。RT-PCR结果显示:构建的干扰载体抑制了BbJEN1的表达。其中有三个干扰载体获得了较好的沉默效果,抑制率分别达到了71%、75%和82%。 接着对转化子和原始菌株进行菌丝生长速度、产孢、孢子萌发以及抗逆性等生物学特征进行了测定。结果显示:转化子与原始菌株间生长速率和产孢量差异不显著,表明BbJEN1基因与菌丝生长和产孢无关。二者孢子萌发率无显著差异,但转化子孢子萌发时间却明显滞后:原始菌株的孢子萌发中时为14.24±0.58h,而导入PRNAi-1、PRNAi-2、PRNAi-3和pbarGPE1-RNAi的菌株分别为14.45±0.79h、16.22±1.02h、16.13±1.66和16.00±0.41h。经抗逆性测试发现,各转化子的活孢率均低于野生菌株,其中导入PRNAi-2,PRNAi-3和pbarGPE1-RNAi致使BbJEN1基因沉默的菌株活孢率显著低于野生菌株差,而导入PRNAi-1的菌株与野生菌株差异不显著。这说明BbJEN1基因与抗逆性有关。 对马尾松毛虫(Dendrolimus punctatus)进行生物测定的结果显示:对于原始菌株Bb13,最低剂量引起的累计校正死亡率为14.68±5.25%,最高剂量的累计校正死亡率为87.07±7.67%。而基因沉默菌株Bb13-S的最低剂量累计校正死亡率为6.92±4.98%,最高剂量的累计校正死亡率为71.56±4.96%,分别低于原始菌株。野生型菌株Bb13两个浓度2.5×107和1.25×108的致死中时分别为6.49±0.39天和5.57±0.28天,Bb13-S两个浓度2.5×107和1.25×108的致死中时分别为8.09±0.41天和7.17±0.36天,均较野生菌株长1.60天,杀虫速度平均降低26.65%。Bb13的致死中浓度和致死中量分别为2.79×106±0.21×106conidia mL-1和84.12±4.11 conidia mm-2 ,而Bb13-S的致死中浓度和致死中量分别提高为1.27×107±0.19×107 conidia mL-1和382.92±24.32 conidia mm-2,相对野生型菌株平均增加了3.6倍的孢子用量。从致死中时、累计死亡率、致死中浓度和致死中量看,改造后的菌株Bb13-s的毒力较野生型菌株有明显下降,从而证明BbJEN1基因是一个与毒力相关的基因。
【学位授予单位】:安徽农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:Q78

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