苦楝内生真菌生物多样性及其代谢产物生物活性的研究

【摘要】： 本研究以在安徽、江苏、陕西的部分地区采集的苦楝为研究对象,通过对苦楝内生真菌的分离、纯化、培养、鉴定以及活性代谢产物的提取工艺等方面的研究,对资源的综合利用进行探索研究。 从安徽农大校园、安徽灵璧、江苏无锡、陕西咸阳的苦楝的根、枝、叶、叶柄、花和果实进行了初步研究分离培养,共获得290株内生真菌,经分离纯化、形态观察、显微鉴定,它们分属于1亚门、5目、6科、11属,显示该植物内生真菌的多样性,并且发现同一植株的不同生长部位以及不同季节内生真菌的类群不同,其中交链孢属占总数的24.14%,为分离率高、数量大的优势类群。对不产孢的部分活性较强菌株进行分子生物学鉴定,经测序发现:KL233与在GenBank中登录的Pyrenochaeta romeroi的ITS区相似率为83%,故可初步判断该菌株疑似为刺盘孢菌属真菌,也可能是新种。KL037与在GenBank中登录的Phomopsis sp.的ITS区相似率为99%,故可判断该菌株为拟茎点霉属真菌。KL259与在GenBank中登录的Arthrinium sp.的ITS区相似率为100%,故可判断该菌株为节菱孢属真菌。KL017与在GenBank中登录的Isaria farinosa的ITS区相似率为100%,故可判断该菌株为粉棒束孢真菌。 对60株有代表性的苦楝内生真菌的代谢物的生物活性拮抗筛选研究发现,有48株(占80.0%)苦楝内生真菌在平板拮抗水平上,至少对其中一种植物病原真菌表现出不同程度的抗性,它们有可能发展成为对这些植物病害进行生物防治的良好的微生物资源。菌株KL233液体发酵产物具有较高的抗菌活性,对玉米小斑病、棉花枯萎病、小麦赤霉病、苹果炭疽病四种指示菌的菌丝生长抑制作用明显优于其它菌株,抑菌圈直径也大于其它菌株。稳定性测试的结果显示:KL233菌株光稳定性和贮藏稳定性较好,而热稳定性和pH稳定性稍差。比较不同提取方法的提取处理及相关理化试验,确定了活性物质的最佳的提取工艺为:40℃条件下浓缩发酵液至原体积的1/5,加3倍体积95%乙醇(乙醇终浓度为70%)醇沉,静置过夜,5000rpm下离心10min去除沉淀并脱醇浓缩至一定体积后,以乙酸乙酯为萃取剂,按2:1的体积比分两次萃取,合并脂溶相,浓缩至原脂溶相体积的1/10,即得到KL233活性代谢产物的粗提品。 对30株生长良好的具有代表性的菌株做致病性测试,结果发现KL017、KL025、KL031、KL042、KL062和KL107相对于其他24株菌株对马尾松毛虫有较强的致病性,其中致病性最强的一株是KL042在2.5d时校正死亡率达到83.33%,在处理第5d时校正死亡率达到100%,经鉴定此菌株为球孢白僵菌。球孢白僵菌作为一种内生真菌,在国内还未见报道。 对柳兰叶甲Plagiodera versicolora进行胃毒(饲喂法)试验,对9株代谢生长旺盛的内生真菌发酵液的浓缩液进行了生物活性测定,结果发现KL017在处理24h和48h后的校正死亡率分别达到93.33%和90.09%,与其他内生真菌代谢产物的生物活性差异显著。把发酵液滴到马尾松毛虫的前胸和背板上后,对触杀结果进行统计分析发现,KL042、KL062和KL017代谢产物对松毛虫的触杀作用强,相对于其它各处理差异显著。其中KL042在24h和48h的校正死亡率分别达到20.00%和76.67%,触杀活性最强。 利用薄层层析(TLC)对获得的120株内生真菌发酵提取物进行初筛,再通过高效液相色谱—质谱(HPLC—MS)复筛,最终从采自安徽灵璧苦楝树叶中分离获得一株产苦楝素的菌株,即KL062菌株,经鉴定属于交链孢属Alternaria。