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茶树中花青素还原酶的研究

张宪林  
【摘要】: 儿茶素类是茶多酚的主体组分,是茶叶最重要的特征代谢成分,同时也是构成茶叶品质的主要化学成分。 在儿茶素合成途径中涉及到很多酶类,主要有苯丙氨酸脱氨酶(phenylalanine ammonialyase,PAL、肉桂酸羧化酶(cinnamate 4-hydroxylase,C4H)、4-香豆酰CoA连接酶(4-coumaroyl-CoA ligase,4CL)、查耳酮合成酶(chalcone synthase,CHS)、:查耳酮异构酶(chalcone isomerase , CHI)、二氢黄酮3-羟化酶((2S)-flavanone 3-hydroxylase,F3H);黄烷酮3’-羟化酶(flavonoid 3’-hydroxylase ,F3’H)、黄烷酮3’,5’-羟化酶(flavonoid 3’, 5’-hydroxylase, F3’5’H)、二氢黄烷醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)、无色花色素还原酶(leucoanthocyanidin reductase ,LAR)、花青素合成酶(anthocyanidin synthase,ANS)、花青素还原酶(anthocyanidin reductase,ANR)、没食子转移酶(galloyl transferase)。其中ANR是与儿茶素EC和EGC合成直接相关的酶类。本实验首先利用TLC、HPLC、分光光度法对茶叶中ANR反应产物形成和辅酶消耗进行了鉴定;建立了ANR酶活性的分光光度检测方法,该方法具有成本低、操作简单的特点;从最适温度、pH、酶蛋白、底物浓度的方面,对ANR反应体系的检测条件进行了研究;研究了不同季节和茶树不同部位鲜叶中儿茶素EC和EGC的含量与ANR活性间的相关性;对EC、EGC、C、GC之间的异构化与羟基化做了初步的研究。 主要研究结果如下: 1.利用高效液相色谱(HPLC)、薄层层析(TLC)、分光光度法分别对ANR酶促反应的产物儿茶素EC和EGC的形成和辅酶NADPH消耗进行鉴定。 2.建立了以辅酶NADPH消耗为基础的ANR活性的分光光度检测方法,并对影响ANR活性检测体系的条件进行了研究。结果表明,1.5毫升ANR反应体系中包括0.0625mmol/L CYA或DEL,0.5mmol/L Vc, 1mmol/L NADPH和0.1 mol/L pH6.5磷酸缓冲液和酶提取液若干(含150微克蛋白),于45℃反应20min,用紫外分光光度计记录340nm处吸光度的变化。该方法的建立为进一步分离纯化酶蛋白打下良好的基础。 3.对不同季节、茶树不同部位鲜叶中的儿茶素组分、DFR/LAR和ANR活性进行了测定,结果表明,在春,夏,秋三个季节,鲜叶中ANRCYA的活性均高于ANRDEL,ANRCYA和ANRDEL的活性在三叶中最高,EC与EGC在鲜叶中的含量与ANR活性相关性并不大;鲜叶中DFR/LARDHM的活性高于DFR/LARDHQ,茶叶幼嫩程度越高,DFR/LAR活性也越高, DFR/LAR活性变化与儿茶素GC的变化呈正相关。茶树体内儿茶素含量高低可能不仅仅受到合成途径的影响,也会受到儿茶素相互间异构、酯型儿茶素水解、羟基化反应的影响。 4.对EC、EGC、C、GC之间的异构化与羟基化做了研究。结果表明儿茶素相互间不存在明显的酶促异构化反应;可能存在从儿茶素EC到EGC的羟基化酶促作用。


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