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《安徽医科大学》 2011年
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WWOX在胆管癌组织中的表达及其对胆管癌细胞生物学行为的影响

朱凯  
【摘要】:序言胆管癌是起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤,其特点是起病隐匿、缺乏理想的早期诊断标志物、手术切除率低、对常规放化疗缺乏敏感性,因此胆管癌患者的预后极差。WWOX是一种重要的抑癌基因,在多种肿瘤中被发现表达缺失。本研究首先检测胆管癌组织和正常胆管组织中WWOX蛋白表达情况,继而运用基因转染技术建立稳定表达WWOX的胆管癌细胞株QBC939/WWOX,观察其体内外对胆管癌细胞生物学行为的影响,并进一步探讨可能的机制及相关途径。目的通过构建重组人WW结构域的氧化还原酶(WWOX)基因真核表达质粒,探讨WWOX基因对胆管癌细胞株QBC939生长的影响及其作用机制,寻求胆管癌基因治疗的新途径。 方法采用免疫组化方法检测胆管癌组织和正常胆管组织中WWOX蛋白表达情况。将携有WWOX基因的真核表达载体转染胆管癌细胞系QBC939细胞(QBC939/WWOX组),筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染空载质粒(QBC939/con组)及未经转染(自然生长组)的QBC939细胞作为对照。荧光定量RT-PCR和Western印迹法检测WWOX在QBC939细胞中的表达情况;MTT实验检测转染前后各组细胞增殖活性;FCM法检测各组细胞的凋亡;JC-l染色法检测细胞线粒体膜电位(△Ψm);Transwell小室侵袭实验检测各组肿瘤细胞侵袭力;荧光定量RT-PCR和Western印迹法检测胆管癌细胞bcl-2、bax、FasL、caspase-3表达的变化。将未转染和转染空质粒的细胞作为对照组接种到裸鼠皮下以检测荷瘤, TUNEL方法原位检测移植瘤的凋亡。 结果WWOX在胆管癌中的表达显著低于正常胆管组织,蛋白表达的缺失频率为40.74%,差异有统计学意义(P0.05)。建立稳定表达WWOX基因的QBC939/WWOX细胞株,mRNA及蛋白表达明显增加。转染后的QBC939细胞MTT吸光度明显下降(P0.05),FCM显示QBC939/WWOX组细胞的凋亡率明显增高(P0.01),JC-l显示转染后的线粒体膜电位下降(P0.01),侵袭实验显示转移至下室滤膜的细胞数明显减少(P0.01)。荧光定量RT-PCR结果显示bcl-2 mRNA表达是自然生长组的0.12倍,bax、caspase-3 mRNA分别是自然生长组的4.72和2.57倍,FasL mRNA的表达无明显变化,是自然生长组的1.04倍;Western印迹法检测发现bcl-2蛋白的表达显著降低,bax、caspase-3蛋白表达升高,FasL无明显变化。转染组的皮下肿瘤较对照组生长速度明显减慢(P0.05),TUNEL实验证实转染组的皮下肿瘤凋亡指数为(13.6±1.3)%,较对照组明显增高(P0.01)。 结论抑癌基因WWOX通过诱导胆管癌细胞凋亡发挥抗肿瘤增殖的作用,其机制与激活线粒体凋亡通路有关。
【学位授予单位】:安徽医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R735.8

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