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《安徽医科大学》 2013年
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小窝蛋白-1在大鼠脂多糖性肺损伤中的作用机制

张丹  
【摘要】:目的 研究脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)致肺损伤大鼠肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cell, PMVEC)及肺组织内小窝蛋白-1(caveolin-1, Cav-1)表达的变化,观察LPS对PMVEC通透性的影响,探讨蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)抑制剂在LPS诱导PMVEC通透性变化及Cav-1表达中的干预作用,为进一步研究Cav-1在大鼠LPS性肺损伤发病机制中的作用提供实验依据。 方法 体外分离培养RPMVEC;通过检测跨内皮细胞电阻以及伊文思蓝-白蛋白法观察LPS对RPMVEC单层通透性的影响;采用免疫印迹技术(western-blotting technique)检测RPMVEC中Cav-1蛋白的表达;构建LPS致大鼠ALI模型,通过苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining, HE)观察肺组织病理学变化;采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcript polymerase chain reaction, RT-PCR)、 Western-blotting及免疫组织化学法技术分别检测肺组织内Cav-1蛋白及mRNA表达。 结果 1.体外成功分离、培养出RPMVEC,并经形态学及异硫氰酸标记的植物凝集素结合实验鉴定证实。 2.10μg/ml LPS刺激RPMVEC不同时间(0h、1h、3h、6h、12h、24h)后发现,LPS时间依赖性增加RPMVEC单层通透性:Pd于刺激后1h即升高,3h后达高峰、显著增加的Pd持续到刺激后24h;同Pd变化,LPS刺激RPMVEC单层时,TER呈时间依赖性下降。10μmol/L PKI预孵育,能进一步加重LPS诱导增加的RPMVEC单层通透性。 3.10μg/ml LPS刺激RPMVEC, Cav-1蛋白表达于1h开始上升,3h达峰值,之后渐下降,但至24h仍高于孵育0h组,各组间差异有统计学意义(P0.01); 4.LPS刺激RPMVEC10min后,Cav-1氨基端的第14位酪氨酸被磷酸化,30min达高峰,然后开始下降,120min后恢复到基础水平。而PKI预孵育后,LPS诱导增加的Cav-1及其磷酸化表达进一步增加。 5.5μg/ml LPS成功复制大鼠肺损伤模型。 6.LPS以时间依赖方式下调大鼠肺组织Cav-1mRNA及蛋白表达。 7.与LPS刺激6h组相比,甲泼尼龙组肺组织病理损伤程度减轻,可部分抑制LPS对肺组织Cav-1mRNA及蛋白表达的下调作用。 结论 1.LPS呈时间依赖性增加RPMVEC单层通透性。 2.LPS以时间依赖的方式上调RPMVEC中Cav-1蛋白及其磷酸化蛋白的表达。 3.PKA抑制剂单独作用可引起RPMVEC单层通透性增加,且对LPS的致通透性损伤作用有协同作用,其机制可能与其上调LPS对RPMVEC中Cav-1及磷酸化Cav-1的诱导效应有关。 4.LPS致大鼠肺损伤模型中肺组织Cav-1表达下调。 5.甲泼尼龙可部分抑制LPS对大鼠肺组织Cav-1表达的下调作用,有效减轻肺损伤程度。
【学位授予单位】:安徽医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R563

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【参考文献】
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