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《安徽医科大学》 2014年
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自噬通路在泛素连接酶Hrd1介导的α1-抗胰蛋白酶Z突变体降解中的作用

朱娜  
【摘要】:α1抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin, AAT)属于丝氨酸蛋白酶超家族成员,由肝细胞合成和分泌,可以抑制包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、凝血酶等多种蛋白酶活性,但其主要作用是通过血液循环到达肺部,保护肺组织弹力纤维免受中性粒细胞弹性蛋白酶的水解和破坏。AAT缺乏症是一种常染色体隐性遗传病,由于编码AAT蛋白的基因突变而引起AAT分泌障碍所致,其中最常见的突变为Z型突变,占临床病例的95%以上,该突变编码的蛋白为AAT Z突变体(α1-antitrypsin Z variant,ATZ)。我们的前期研究发现,泛素连接酶Hrd1可促进泛素-蛋白酶体通路介导的细胞内ATZ降解,且Hrd1显著降低SDS不溶性和多聚体ATZ的水平。 目的: 观察Hrd1是否可以通过自噬通路介导ATZ降解,同时探究其相关作用机制。 方法: 1.利用免疫荧光双标观察细胞形态和蛋白定位情况; 2.分别加入放线菌酮(cycloheximide, CHX)抑制蛋白质的合成,MG132抑制蛋白酶体活性,HBSS培养液诱导自噬,BFA1和氯化铵抑制自噬; 3.利用siRNA技术,合成Hrd1-siRNA抑制内源性Hrd1表达,观察ATZ降解的情况; 4. real-time PCR技术检测共表达Hrd1和ATZ后对自噬相关基因Atg5,Atg12和Beclin-1的影响; 5.免疫共沉淀方法(Co-immunoprecipitation, Co-IP)检测ATZ与K48位泛素、p62之间的相互作用。 结果: 1.自噬参与Hrd1介导的ATZ降解 1.1Hrd1促进ATZ与自噬体膜蛋白LC3共定位 哺乳动物细胞内存在两种形式的LC3,即18kDa的LC3-I和16kDa的LC3-II。LC3-I广泛分布于胞浆中,当自噬发生时,Atg7活化LC3并促使LC3与Atg3结合,LC3-I与磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)结合称为LC3-II,LC3-II定位于自噬体膜的两侧。LC3-II的含量或LC3-II/LC3-I的比例与自噬泡的数量呈正相关。因此为了了解ATZ、Hrd1和细胞自噬体膜蛋白LC3在细胞内的定位情况,HEK293T细胞共转染ATZ和Hrd1,并用NH4Cl抑制溶酶体酶活性,同时设立DMSO组作为对照,细胞爬片免疫染色。免疫荧光双标结果显示在氯化铵抑制溶酶体后,共表达ATZ和Hrd1可使细胞浆中的LC3-II发生大量的点状聚集,且Hrd1可促进ATZ与LC3共定位,提示Hrd1可能介导ATZ到达溶酶体中降解。 1.2自噬诱导和抑制对Hrd1介导ATZ降解的影响 为了进一步确定Hrd1是否介导ATZ通过自噬途径降解,我们在293T细胞中共转染ATZ和Hrd1后,首先我们使用放线菌酮(cycloheximide, CHX)来阻断ATZ蛋白的合成,再分别加入自噬诱导剂HBSS和自噬抑制剂巴佛洛霉素A1(BafilomycinA1,BFA1),设立空载体对照,免疫印迹检测细胞内ATZ水平变化。实验结果显示,与DMSO组相比,饥饿诱导自噬后,Hrd1能够显著下调ATZ的蛋白水平;溶酶体抑制剂BFA1可部分抑制Hrd1的作用。 1.3抑制内源性Hrd1表达对ATZ自噬降解的影响 293T细胞中共转染ATZ和Hrd1-siRNA,设立空载体对照,观察内源性Hrd1表达抑制后对ATZ自噬降解的影响。免疫印迹结果显示,与对照组相比,抑制内源性Hrd1的表达使细胞内ATZ水平增高。 1.4Hrd1对ATZ的自噬降解与其E3活性有关 为了进一步明确Hrd1介导ATZ的自噬降解是否与其E3活性有关,我们分别将HEK293T细胞共转染ATZ和Hrd1或Hrd1C1A的cDNA,24hrs后在细胞的培养上清液中加入BFA1,然后检测细胞内的ATZ水平。结果发现,Hrd1C1A不能促进ATZ的降解,加入BFA1后细胞内ATZ水平也无明显变化。提示Hrd1介导的ATZ自噬降解与其E3活性有关。 1.5Hrd1介导不溶性ATZ通过自噬降解 以前的研究发现Hrd1在降低ATZ总体水平的同时轻度增加SDS可溶性ATZ水平,显著降低SDS不溶性和多聚体ATZ的水平,且有研究发现自噬通路主要降解ATZ的聚集体部分,据此我们推测Hrd1是否介导不溶性ATZ通过自噬通路降解。为了验证这一设想,我们用免疫印迹实验分别检测细胞上清和沉淀中的ATZ,实验结果发现,Hrd1能明显降低沉淀中ATZ的水平,而加入NH4Cl后抑制了Hrd1介导的ATZ降解,该结果提示Hrd1可通过自噬通路介导不溶性ATZ降解。 1.6Hrd1对自噬相关基因Atg5,Atg12和Beclin-1的影响 通常情况下,细胞自噬的发生依赖于一系列Atg家族蛋白,其中Beclin1是酵母Atg6/Vps30基因在哺乳动物中的同源物,通过与Class Ⅲ PI3K形成复合物参与自噬体初期自噬体膜的形成;另外,Atg5在细胞内形成Atg12-Atg5复合物,能促使LC3-I向LC3-II的转变,对自噬体膜的延伸至关重要。为了进一步验证Hrd1对自噬的影响,我们在HEK293T中共表达ATZ与Hrd1,提取RNA进行real-timePCR检测Atg5、Atg12以及Beclin1的mRNA水平。实验结果发现,共表达ATZ和Hrd1明显增加自噬相关基因Atg5、Atg12的mRNA水平,Beclin1水平也有所提高。 2Hrd1促进ATZ K48位点泛素化 泛素是一个由76个氨基酸组成的高度保守的多肽链,因其广泛分布于各类细胞而得名。泛素共价地结合于底物蛋白质的赖氨酸残基,被泛素标记的蛋白质将被特异性地识别并迅速降解。靶蛋白的泛素化降解是一个涉及E1泛素激活酶,E2泛素结合酶,以及E3泛素连接酶的酶促反应。一个泛素分子内部的七个赖氨酸残基(K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63)之一和前面的泛素分子形成一个多聚泛素链。不同的泛素化连接方式有不同的生物学功能,例如K48连接的多泛素链介导泛素化靶蛋白进行蛋白酶体降解,K63连接的多泛素化最近已经显示出参与多种细胞过程,包括细胞内吞作用,信号转导和DNA损伤的调节等与蛋白酶体无关的作用。为了探究Hrd1介导ATZ的泛素化方式,HEK293T共转染Hrd1和ATZ,加入自噬抑制剂BFA1,免疫荧光双标结果显示Hrd1和ATZ可以与K48共定位,而与K63无共定位。免疫共沉淀结果提示ATZ与Hrd1以及K48可能存在相互作用,Hrd1可能促进ATZ的K48位泛素化。 3. p62参与Hrd1介导的ATZ的自噬通路降解 3.1Hrd1与ATZ及p62共定位 p62是自噬发生发展过程中起重要作用的蛋白。大量研究结果表明:泛素化的蛋白能够通过p62的UBA结构域与p62发生结合,而p62又可通过其自身的LIR区域与自噬体膜蛋白LC3直接相互作用形成三者的复合物,并由LC3转运至自噬体,最后通过自噬体/溶酶体降解,p62本身也能被自噬降解,故p62可作为自噬活性的标志分子。前述实验已经证实Hrd1可以泛素化ATZ,我们想知道泛素化的ATZ是否与p62相互作用。首先我们在293T细胞转染ATZ和Hrd1,24hrs后加入自噬抑制剂BFA1,6hrs后固定细胞,免疫荧光染色标记ATZ、Hrd1和p62三种蛋白,激光共聚焦显微镜观察三者在细胞内的定位情况,结果显示三者在细胞内共定位。 3.2ATZ与p62相互作用 为了进一步证实Hrd1、ATZ与p62之间的相互作用,293T细胞转染ATZ和Hrd124hrs后,加入自噬抑制剂BFA1,6hrs后收集细胞裂解,免疫沉淀AAT后免疫印迹观察p62与ATZ的相互作用,结果显示ATZ与p62存在相互作用。结论Hrd1可介导ATZ K48位点泛素化,促进泛素化的ATZ与p62的相互作用识别并结合,从而促进自噬体中溶酶体途径介导的ATZ降解。
【学位授予单位】:安徽医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R363

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