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《安徽医科大学》 2015年
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黄芪甲苷对实验性糖尿病血管病变的保护作用及机制研究

马玉红  
【摘要】:第一部分黄芪甲苷对糖尿病大鼠主动脉病变的影响目的:观察黄芪甲苷(astragalosideⅣ,ASTⅣ)对糖尿病(diabetes mellitus,DM)模型大鼠血管病变的保护作用,分析其可能的作用机制。方法:采用高糖高脂饮食4 w联合一次性腹腔注射(intraperitoneal injection,ip)链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)35 mg/kg复制大鼠DM模型。选择造模成功(血糖16.7 mmol/L)的大鼠随机分组为:模型组(Model,等容量羧甲基纤维素钠,ig)、ASTⅣ低、中、高剂量组(20、40、80 mg/kg/d,ig)、胰岛素(insulin,Ins)组(0.15 U/kg/d,ih),另设正常对照组(Control,等容量羧甲基纤维素钠,ig),连续给药12 w。实验过程中观察各组大鼠一般状况(精神、饮食饮水、大小便等)以及测量各组大鼠体重、血糖(blood glucose,BG)的变化;并于末次给药结束后取血,采用生化法检测红细胞糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin,GHb)含量、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)、胆固醇(cholesterol,CHOL)、甘油三酯(triglyceride,TG)和高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)含量;比色法检测血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;生化法检测血浆部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)和凝血酶原时间(prothrombin time,PT);放射免疫法检测空腹血清胰岛素(fasting insulin,FISN)水平;酶联吸附免疫法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测晚期糖基化产物(advanced glycation end products,AGEs)水平;HE染色法观察各组大鼠主动脉病理组织形态学变化;透射电子显微镜(electron microscope,EM)观察主动脉内皮细胞超微结构病变情况;免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)观察主动脉内皮细胞TGF-β1阳性细胞表达情况;定量PCR(quantitative polymerase chain reaction,QPCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)法分别检测主动脉Nox4、TGF-β1、Smad2、BCL-2、BAX、Caspase 3的m RNA和蛋白表达水平。结果:(1)与正常组相比,模型组DM大鼠精神萎靡,倦卧少动,多饮多食多尿,毛发脱落,体重降低(P0.01),主动脉脏器指数增加(P0.05)。与模型组相比,ASTⅣ(40、80 mg/kg)和Ins组精神好转,活动增多,三多一少症状减轻,毛发脱落较少,体重增加在第12 w、16 w有统计学意义(P0.05,P0.01)。(2)模型组DM大鼠造模后BG显著升高,血清LDL、CHOL和TG含量显著增高,HDL含量显著降低,红细胞GHb含量明显增加,血清FISN水平明显增加(P0.01)。与模型组比较,ASTⅣ(40、80 mg/kg)组在12 w、16 w血糖下降(P0.05,P0.01),而Ins组在给药后出现明显降血糖作用(P0.01)。ASTⅣ(40、80 mg/kg)和Ins组能显著降低血清LDL、CHOL和TG含量,升高HDL含量,降低红细胞GHb含量,降低血清FISN水平(P0.05,P0.01)。(3)模型组DM大鼠血清AGEs水平显著增多,血浆PT和APTT显著缩短(P0.01)。ASTⅣ(40、80 mg/kg)和Ins组可降低血清AGEs水平,延长PT和APTT(P0.05,P0.01)。(4)HE染色结果显示模型组DM大鼠主动脉内皮细胞层及内膜和外膜均未见明显改变,仅中层平滑肌排列稍紊乱;但透射电镜结果显示模型组DM大鼠主动脉内皮细胞与平滑肌细胞层分离、胞膜皱缩、胞体内部分线粒体空泡变性、粗面内质网轻度扩张、核固缩,提示主动脉内皮细胞已出现明显的超微结构损伤。ASTⅣ各剂量组和Ins组可减轻主动脉内皮细胞超微结构损伤。(5)模型组DM大鼠血清SOD活力显著降低,MDA含量明显增高,主动脉Nox4m RNA和蛋白表达显著增高(P0.01)。ASTⅣ各剂量组和Ins组可显著升高血清SOD活力,降低MDA含量,下调主动脉Nox4 m RNA和蛋白表达(P0.05,P0.01)。(6)模型组DM大鼠主动脉TGF-β1和Smad2 m RNA和蛋白表达显著增高(P0.01);IHC结果显示模型组DM大鼠主动脉内皮细胞中TGF-β1阳性细胞显著增多(P0.01)。ASTⅣ(40、80 mg/kg)和Ins组可明显下调DM大鼠主动脉TGF-β1和Smad2 m RNA和蛋白表达,减少主动脉内皮TGF-β1阳性表达细胞数量(P0.05,P0.01)。(7)模型组DM大鼠主动脉BAX和Caspase 3 m RNA和蛋白表达显著增高,BCL-2m RNA和蛋白表达显著降低(P0.01);ASTⅣ(40、80 mg/kg)和Ins组可明显下调DM大鼠主动脉BAX和Caspase 3 m RNA和蛋白表达,上调BCL-2 m RNA和蛋白表达水平(P0.05,P0.01)。结论:(1)高糖高脂饮食4 w联合STZ 35 mg/kg ip成功复制大鼠DM模型。(2)ASTⅣ对DM大鼠主动脉损伤具有保护作用。(3)ASTⅣ保护作用机制可能与调节糖脂代谢紊乱,减少氧化应激损伤,抑制TGF-β1/Smad2表达,调节凋亡相关基因BCL-2、BAX和Caspase 3表达有关。第二部分黄芪甲苷对H2O2诱导HUVECs凋亡的影响目的:观察ASTⅣ对过氧化氢(hydrogenperoxide,H2O2)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)损伤的保护作用,以及对Nox4/ROS/TGF-β1/Smad2表达的影响。分析ASTⅣ保护作用的可能机制。方法:体外实验采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]法检测ASTⅣ的半数有效浓度(effective concentration 50,EC50);Annexin-V/PI双染后用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测细胞凋亡率;采用FCM检测细胞内反应氧产物(reactive oxygen species,ROS)含量;QPCR和WB法分别检测各组Nox4、TGF-β1、Smad2、BCL-2、BAX和Caspase 3的m RNA和蛋白表达水平。结果:(1)H2O2可增加HUVECs凋亡率,上调Nox4表达,升高ROS水平,上调TGF-β1、Smad2、BAX和Caspase 3的表达,下调BCL-2表达。(2)ASTⅣ(100μmol/L)可降低细胞凋亡率,显著下调Nox4表达,降低ROS水平,下调TGF-β1、Smad2、BAX和Caspase 3表达,上调BCL-2表达。(3)二苯碘(Diphenyliodonium,DPI)抑制Nox4表达,降低细胞凋亡率,降低ROS水平,下调TGF-β1/Smad2表达,调节凋亡相关基因表达。(4)LY2109761抑制TGF-β1/Smad2表达,减少细胞凋亡率,调节凋亡相关基因的表达,但是对Nox4的表达及ROS的水平无显著影响。结论:(1)H2O2可通过上调Nox4表达,减少ROS生成,上调TGF-β1/Smad2表达,导致HUVECs细胞凋亡。(3)ASTⅣ对H2O2诱导HUVECs损伤具有保护作用,其具体机制可能与下调Nox4表达,抑制ROS生成,下调TGF-β1/Smad2表达,调节凋亡相关基因的表达有关。
【学位授予单位】:安徽医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R285.5

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