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《安徽医科大学》 2015年
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双酚A对小鼠腹腔巨噬细胞极化影响的体外研究

李美玲  
【摘要】:研究背景人工合成化学物双酚A (Bisphenol A, BPA)已经成为世界上最高产量的化学物之一。主要用于聚碳酸酯塑料和环氧树脂的生产。聚碳酸酯塑料广泛用于饮料容器和食品包装袋的生产。环氧树脂主要用于食品罐头的食物接触面。在加热及碱性或者酸性环境下,BPA单体会从这些包装容器里释放出来进入到环境和食物中。人们在食用这些容器包装的食物时,会摄入BPA。生物监测数据表明,超过90%的人暴露于BPA,在他们的血液和尿液中都可以检测到BPA或其代谢产物。BPA是一种已知的环境内分泌干扰化学物(environmental endocrine disrupting chemical, EDC),具有弱雌激素活性,可以对包括内分泌、神经行为、生殖发育等产生不良影响。大量的研究表明,BPA暴露与肥胖以及肥胖相关的胰岛素抵抗具有明显的相关,而肥胖是机体处于一种全身低度的慢性炎症状态,表现为脂肪组织中大量脂肪组织巨噬细胞(adipose tissue macrophages, ATMs)浸润。在肥胖发生和发展过程中,浸润在内脏脂肪组织的巨噬细胞分泌的细胞因子,损害脂肪细胞分泌有益的脂肪因子和储存脂质的功能。巨噬细胞在脂肪组织的聚集和浸润与其极化状态明显相关。巨噬细胞可分为经典激活的发挥促炎作用的M1型(F4/80+CD11c+ CD206-)和替代活化的发挥抗炎作用的M2型(F4/80+CD11c-CD206+)。然而,BPA对巨噬细胞的极化状态的影响,至今也尚未见报道。但这对研究BPA引起胰岛素抵抗的作用机制非常有意义。研究目的通过分析不同浓度BPA对体外诱导极化的小鼠腹腔巨噬细胞亚型(M1和M2型)表面分子、分泌的细胞因子、调控巨噬细胞极化转录因子IRF-4和IRF-5的影响,探讨BPA对体外培养的巨噬细胞极化的影响,为BPA诱导肥胖等代谢紊乱发病机制提供试验依据。研究方法SPF级健康6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠。断头法处死小鼠,无菌条件下向腹部注入含双抗(100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的DMEM培养基5 m1,用注射器抽取腹腔液约4 ml,常温下1000 r·min-1离心8 min,弃上清。调整细胞至所需浓度,接种于6孔培养板,37℃,5% CO2培养箱培养3h。PBS洗去未贴壁的细胞。细胞正常培养24h后,用10ng/mL的IFN-γ和500 ng/mL的LPS诱导其向M1型极化,用10ng/mL的IL-4诱导其向M2型极化。在加入诱导剂的同时用0.1、1和10 μmol/L的BPA处理细胞,用DMSO作溶剂对照。诱导向M1型极化时,先用10 ng/mL的IFN-γ诱导24h,再加入500 ng/mL的LPS刺激细胞24h,然后收集上清和细胞。流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测M1型和M2型巨噬细胞比例。ELISA检测细胞上清中的细胞因子IL-6, iNOS, MCP-1, IL-10,和Arg-1的表达水平。实时荧光定量聚合酶链反应(real time-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)检测IL-6, iNOS, MCP-1, CD11c, IL-10, Arg-1, CD206, IRF4, IRF5的基因表达水平。用SPSS17.0统计软件包对实验结果进行统计分析。结果1小鼠腹腔巨噬细胞体外诱导极化结果1.1诱导前后细胞形态变化小鼠腹腔巨噬细胞用M1型巨噬细胞诱导剂诱导后,细胞呈圆形(M1型巨噬细胞形态),用M2型巨噬细胞诱导剂诱导后,细胞呈成纤维细胞样(M2型巨噬细胞形态)。1.2诱导前后M1型和M2型巨噬细胞的数量变化FCM检测M1型巨噬细胞的比例较诱导前升高2.50倍,差异有统计学意义(P0.01);M2型巨噬细胞的比例升高2.33倍,差异有统计学意义(P0.01)。1.3诱导前后M1型和M2型巨噬细胞分泌的细胞因子的变化ELISA检测M1型巨噬细胞分泌的细胞因子iNOS明显升高,差异有统计学意义(P0.01), M2型巨噬细胞分泌的细胞因子Arg-1明显降低,差异有统计学意义(P0.01)。2不同剂量BPA对体外诱导的小鼠腹腔巨噬细胞向M1型极化的影响2.1对M1型巨噬细胞数量的影响与空白对照组相比,溶剂对照组和0.1μmol/L BPA组的M1比例差异无统计学意义,而1和10μmol/L BPA组的M1比例升高(P0.05,P0.01)。2.2对M1型巨噬细胞表面分子CD11c mRNA表达水平的影响与空白对照组相比,溶剂对照组和0.1 μimol/L BPA组的CD11c mRNA表达水平差异没有统计学意义,而1μmol/L BPA组和10μmol/L BPA的CDllc表达水平明显升高(P0.01,P0.01)2.3对M1型巨噬细胞分泌的细胞因子的影响2.3.1对M1巨噬细胞分泌的细胞因子含量或活性的影响与空白对照组相比,溶剂对照组和0.1μmol/L BPA组的M1型巨噬细胞分泌的促炎性细胞因子IL-6, iNOS, MCP-1差异无统计学意义,而1和10μmol/L BPA组IL-6, iNOS, MCP-1表达升高(P0.01,P0.01)2.3.2对M1型巨噬细胞分泌的细胞因子mRNA表达水平的影响与空白对照组相比,溶剂对照组和0.1μmol/L BPA组的M1型巨噬细胞分泌的足炎性细胞因子IL-6, iNOS, MCP-1 mRNA表达水平差异无统计学意义,而1μmol/L BPA组和10μmol/L BPA组IL-6, iNOS, MCP-1 mRNA表达与空白对照组相比,显著升高(P0.01,P0.01,P0.01)。3不同剂量BPA对体外诱导的小鼠腹腔巨噬细胞向M2型极化的影响3.1对M2型巨噬细胞数量的影响与空白对照组相比,溶剂对照组和0.1μmol/L BPA组的M2比例差异无统计学意义,而1和10μmol/L BPA组的M2比例下降(P0.05,P0.01)。3.2对M2型巨噬细胞表面分子CD206 mRNA表达水平的影响与空白对照组相比,溶剂对照组和0.1μmol/L BPA组的M2型巨噬细胞表面分子CD206 mRNA表达水平差异无统计学意义,而1和10μmol/L BPA组的CD206mRNA表达显著降低(P0.05,P0.01)。3.3对M2型巨噬细胞分泌的细胞因子的影响3.3.1对M2型巨噬细胞分泌的细胞因子含量或活性的影响与空白对照组相比,溶剂对照组和0.1μmol/L BPA组的M2型巨噬细胞分泌的抗炎性细胞因子IL-10和Arg-1差异无统计学意义,而1μmol/L BPA组和10μmol/LBPA组IL-10和Arg-1表达下降(P0.01,P0.01)。3.3.2对M2型巨噬细胞分泌的细胞因子mRNA表达水平的影响与空白对照组相比,溶剂对照组和0.1μmol/L BPA组M2型巨噬细胞分泌抗炎主细胞因子IL-10和Arg-1 mRNA表达水平差异无统计学意义,而1μmol/L BPA组IL-10和Arg-1 mRNA表达显著降低(P0.05,P0.01),10μmol/L BPA组IL-10和Arg-1 mRNA表达也显著降低(P0.05,P0.05)。4 BPA对体外诱导小鼠腹腔巨噬细胞极化中IRF4和IRF5 mRNA水平的影响4.1 BPA对体外诱导小鼠腹腔巨噬细胞极化中IRF4和IRF5 mRNA水平的影响M1型极化中:各剂量BPA组的转录因子IRF4 mRNA表达水平差异均没有统计学意义;与空白对照组相比,溶剂对照组和0.1 μmol/L BPA组的IRF5的mRNA表达水平差异没有统计学意义,而1 μmol/L BPA组和10μmool/L BPA组IRF5mRNA表达水平明显升高(P0.01,P0.01)。M2型极化中:与空白对照组相比,溶剂对照组,0.1μmol/L BPA组和1μmol/LBPA组IRF4的mRNA表达水平差异没有统计学意义,而10μmol/L BPA组IRF4表达水平明显降低(P0.01);各剂量BPA组的转录因子IRF5 mRNA表达水平差异均没有统计学意义。4.2转录因子IRF4和IRF5与巨噬细胞亚型比例的相关性相关性分析显示,转录因子IRF5与M1型巨噬细胞有显著正相关性(相关系数 r=0.629,P=0.012)。结论1体外条件下,IFN-γ能够诱导巨噬细胞向M1型极化;IL-4能够诱导巨噬细胞向M2型极化。型巨噬细胞的数量,升高M1型巨噬细胞特异性表面分子CD11c的mRNA的表达,足进M1型巨噬细胞分泌的细胞因子IL-6, iNOS, MCP-1的表达。3体外条件下,低浓度的BPA抑制小鼠腹腔巨噬细胞向M2型极化,减少M2型巨噬细胞的数量,降低M2型巨噬细胞特异性表面分子CD206的mRNA的表达,抑制M2型巨噬细胞分泌的抗炎性细胞因子IL-10, Arg-1的表达。4 BPA可能通过转录因子IRF5调控巨噬细胞向M1型极化。
【学位授予单位】:安徽医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R114

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