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关键信号转导通路在系统性红斑狼疮患者中的多组学和功能研究

梁言  
【摘要】:研究背景系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种累及多器官、多系统、病程迁延反复的自身免疫性疾病。过去十年间,学者们对SLE的发病机制进行了研究,发现在SLE患者中,多个生物分子在基因m RNA、蛋白质和(或)代谢物层面上表达异常。虽然这些发现加深了人们对SLE发病机制的了解,但是,单纯研究个别分子无法解释复杂的生物学反应。随着科学技术的发展,科学家发明了转录组、蛋白组和代谢组等组学技术,这种技术可以鉴定出组织、血液等复杂样本中尽可能多的生物分子并定量,根据病例对照研究的思路,寻找不同组别样本的差异分子,再对这些差异分子进行生物信息学分析。基因本体(gene ontology,GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析是常用的生物信息学分析方法,前者给出与生物分子相关的生物学反应,后者给出了生物分子参与的信号转导通路。组学的研究目标往往是特定类别的生物分子,例如,转录组的研究目标为基因m RNA;蛋白组的研究目标为蛋白质;代谢组的研究目标为代谢物。但是,生物学反应往往是基因m RNA、蛋白组和代谢物共同作用的结果。因此,整合不同平台的组学数据成为必要的工作。转录组与蛋白组表达数据的关联研究是一种思路,它通过比较、分析基因m RNA和蛋白质的表达量,实现数据互补。整合转录组、蛋白组和代谢组KEGG富集分析数据是另一种思路,它为探索疾病的发病机制提供了新的方法。凝血通路和补体通路是机体免疫系统重要的组成部分。近年来,研究发现凝血通路和补体通路相互调节、彼此影响。两条通路的相互作用通常通过两种方式实现:(1)凝血因子和补体因子直接彼此活化;(2)以炎症因子为桥梁,凝血因子和补体因子相互调节。在败血症、血栓等疾病中,凝血通路和补体通路的相互作用与病程的发展密切相关。而相关报道在SLE患者中还非常有限。因此,本研究拟利用转录组、蛋白组和代谢组技术,检测SLE患者和健康人群中基因m RNA、蛋白质和代谢物的表达量,进而鉴定出SLE患者与健康人群之间表达差异的分子,并对这些分子进行生物信息学分析。本研究还将整合转录组和蛋白组中生物分子表达量数据,进行基因m RNA和蛋白质表达关系的关联研究;整合转录组、蛋白组和代谢组中KEGG数据,寻找SLE发病机制中关键信号转导通路;探讨这条通路与SLE患者疾病活动度的关系。研究一SLE患者转录组、蛋白组和代谢组研究目的鉴定SLE患者中表达异常的基因m RNA、蛋白组和代谢物,探讨这些分子参与的生物学反应和信号转导通路。方法采集24例SLE患者和24例健康人群的血液样本,从白细胞中提取RNA,用RNA测序(RNA sequencing,RNA-seq)技术进行转录组实验;从全血中提取血浆,用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,i TRAQ)技术进行蛋白组实验;从全血中提取血浆,用高效液相色谱串联质谱(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)技术进行代谢组实验。转录组和蛋白组实验需要将样本混合,具体来说,转录组实验中,在SLE患者或者健康人群的组内,每8例样本随机混合组成1例样本,由此产生SLE患者和健康人群各3例样本。蛋白组实验中,样本的处理方式与转录组实验相同。另外,蛋白组实验有3次技术重复,即样本重复上机检测3次。转录组实验中,筛选差异基因m RNA的工具为Noiseq软件包,标准为差异倍数≥2、同时偏离概率值≥0.8。蛋白组实验中,筛选差异蛋白的工具为Mascot软件,筛选标准为在3次技术重复中至少有2次差异倍数≥1.200或者≤0.833且P值≤0.05,并且在剩余的重复中表达趋势保持一致。代谢组实验中,筛选差异代谢物的工具为偏最小二乘法辨别分析(partial least-squares discriminant analysis,PLS-DA)和火山图,筛选标准为PLS-DA中变量投影重要性(variable importance in the projection,VIP)≥1并且火山图中差异倍数1.5或者0.67且Q值0.05。GO富集分析探索表达差异的分子参与的生物学反应,KEGG富集分析探索表达差异的分子参与的信号转导通路。转录组与蛋白组表达数据的关联研究首先将基于参考基因得到的蛋白质鉴定数据和转录组数据进行比较,当某一个蛋白质在转录水平上有表达量时,被认为关联到,再将蛋白水平和转录水平关联到的所有分子的表达数据进行Pearson相关分析,最后根据关联到的分子在蛋白水平和转录水平上的表达趋势,统计不同类型分子的数量,一共分成四种情况,分别是:(1)蛋白质和基因m RNA水平上变化趋势相同;(2)蛋白质和基因m RNA水平上变化趋势相反;(3)基因m RNA水平有变化而在蛋白质水平上无变化;(4)蛋白质水平上有变化而在基因m RNA水平上无变化。另外,我们整合转录组、蛋白组和代谢组KEGG数据,寻找SLE发病机制中关键信号转导通路,明确这条通路上表达水平异常的基因m RNA、蛋白组和代谢物,同时,将这些数据映射到一个KEGG图上,得出这条通路上的基因m RNA、蛋白质和代谢物之间的关系。结果(1)转录组实验结果表明,与健康人群相比,SLE患者中420个基因m RNA表达异常,其中190个上调,230个下调。GO富集分析显示这些基因m RNA主要参与淋巴细胞活化、防御反应和白细胞分化等生物学反应。KEGG富集分析显示这些基因m RNA主要参与T细胞受体通路、核因子-k B通路和凝血与补体通路等信号转导通路;(2)蛋白组实验结果表明,与健康人群相比,SLE患者中111个蛋白质表达异常,其中87个上调,24个下调。GO富集分析显示这些蛋白质主要参与炎症反应和氧化应激反应等生物学反应。KEGG富集分析显示这些蛋白质主要参与凝血与补体信号转导通路;(3)代谢组实验结果表明,与健康人群相比,SLE患者中195个代谢物表达异常。KEGG分析显示这些代谢物主要参与激素生物学合成通路、色氨酸代谢通路和凝血与补体通路等信号转导通路;(4)生物分子的表达量在蛋白水平和转录水平上的相关性并不高(r=0.174)。将所有在转录水平和蛋白水平能关联到的分子按“方法”部分的描述分成4组,第一组有5个分子,第二组有4个分子,第三组有15个分子,第四组有0个分子;(5)整合转录组、蛋白组和代谢组KEGG数据,发现凝血与补体通路上多个基因m RNA、蛋白组和代谢物表达异常。同时,将这些数据映射到一个KEGG图上,得出凝血与补体通路上的基因m RNA、蛋白质和代谢物之间的关系。结论SLE患者中多个基因m RNA、蛋白质和代谢物表达异常,这些分子参与了多种生物学反应和信号转导通路。SLE患者中,生物分子的表达量在蛋白水平和转录水平上相关性并不高。凝血与补体通路对SLE发病机制非常重要。研究二凝血与补体通路和SLE患者疾病活动度的相关性研究目的研究SLE患者中,凝血与补体通路和疾病活动度的关联,并探讨它们的关联是否受到炎症反应影响。方法酶联免疫吸附检测法(enzyme-linked immunoabsorbent assay,ELISA)测量10个凝血因子、7个补体因子和3个炎症分子在SLE患者中表达量。凝血因子包括因子7(factor 7,F7)、因子9(factor 9,F9)、因子12(factor 12,F12)、因子13(factor 13,F13)、纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)、凝血酶-抗凝血酶复合物(thrombin-antithrombin complex,TAT)、血管假性血友病因子(Von Willebrand factor,VWF)、蛋白S(protein S,PS)、D-二聚体(D-dimer)和抗凝血酶3(antithrombin-III,ATIII)。补体因子包括补体3激活剂(complement 3activator,C3a)、补体4激活剂(complement 4 activator,C4a)、补体5激活剂(complement 5 activator,C5a)、结合甘露糖的凝集素相关丝氨酸蛋白酶2(mannose-binding lectin-associated serine proteinase 2,MASP2)、补体1q(complement 1q,C1q)、补体7(complement 7,C7)和因子I(factor I,FI)。炎症分子包括白介素6(interleukin-6,IL-6)、白介素8(interleukin-8,IL-8),肿瘤坏死因子受体II(tumor necrosis factor-receptor II,TNF-RII)。浊度法定量测定补体4(complement 4,C4)在SLE患者中表达量。SLE患者的临床和实验室数据来自病历资料。样本量为112例。根据研究一的蛋白组和以往的研究结果,将上述凝血因子、补体因子和炎症分子共21个指标分成两部分,即通路激活剂和通路抑制剂。通路激活剂在SLE患者中表达量上升并且表达量与其对应通路的活化程度正相关;通路抑制剂在SLE患者中表达量下降并且表达量与其对应通路的活化程度负相关。根据这些标准,凝血因子VWF、F7、TAT、FIB、F9和D-dimer,补体因子C3a、C4a、C5a、MASP2和C7以及炎症分子TNF-RII、IL-6和IL-8定义为它们各自通路的激活剂;凝血因子PS、F12、F13和ATIII以及补体因子C1q、FI和C4定义为它们各自通路的抑制剂。在通路得分的计算中,激活剂作为正数而抑制剂作为负数。计算补体通路得分的指标包括C3a、C4a、C5a、MASP2、C7、C1q、FI和C4。具体计算步骤:(1)以每个指标为单位,将浓度值进行正态分布检验;(2)成非正态分布的指标进行log转化;(3)将每个指标中的最大值选出,然后将其他值除以最大值;(4)将每个患者中,补体通路的所有指标得出的数值相加,计算出的数值是这个患者补体通路得分。凝血通路得分和炎症反应得分与补体通路得分计算步骤一致。凝血通路得分的指标包括VWF、F7、TAT、FIB、F9、D-dimer、PS、F12、F13和ATIII。炎症反应得分的指标包括TNF-RII、IL-6和IL-8。对凝血通路得分、补体通路得分、炎症反应得分和SLE疾病活动指数(SLE disease activity index,SLEDAI)进行柯尔莫哥洛夫-斯摩洛夫(kolmogorov-smirnov,K-S)正态分布检验,非正态分布的变量进行log转化。Pearson相关分析检验两个变量的相关性。多变量线性回归分析检验因变量和自变量的关系以及自变量间的交互作用。在方差齐性的情况下,用最小二乘差异(least squares difference,LSD)方法检测变量在不同组别中的差异,在方差不齐的情况下,用事后检验[Tamhane’s T2(M)]方法检测变量在不同组别中的差异。采用SPSS13.00软件进行统计分析,检验水准a=0.05。结果(1)凝血通路得分和补体通路得分没有相关性(r=0.151,P=0.112);(2)凝血通路得分、补体通路得分与log转化SLEDAI(log-transformed SLEDAI,lt SLEDAI)的多变量线性回归分析发现(A)凝血通路得分和补体通路得分都与lt SLEDAI正相关(凝血通路得分:β=0.706,95%CI0.371-1.040,P0.001,补体通路得分:β=0.590,95%CI0.328-0.852,P0.001);(B)凝血通路得分和补体通路得分对lt SLEDAI的影响有交互作用(P0.001),具体表现为在补体通路得分低的SLE患者中,凝血通路得分和lt SLEDAI的联系较弱,即在补体通路得分低的SLE患者中,lt SLEDAI在凝血通路得分低的SLE患者和凝血通路得分高的SLE患者之间的差值只有0.334,而这个差值在补体通路得分高的SLE患者中上涨到0.831。类似的,在凝血通路得分低的SLE患者中,补体通路得分和lt SLEDAI的联系较弱,即在凝血通路得分低的SLE患者中,lt SLEDAI在补体通路得分低的SLE患者和补体通路得分高的SLE患者之间的差值只有0.436,而这个差值在凝血通路得分高的SLE患者中上涨到0.933;(3)为了检验补体通路、凝血通路对lt SLEDAI的交互作用是否受到炎症反应的影响,将炎症反应得分按其中位数分成两组。在炎症反应得分高的SLE患者中,凝血通路得分和补体通路得分都与lt SLEDAI正相关(凝血通路得分:β=1.047,95%CI0.602-1.491,P0.001,补体通路得分:β=0.437,95%CI0.130-0.744,P=0.006);交互作用结果表明凝血通路得分和补体通路得分对lt SLEDAI的影响有交互作用(P0.001),具体表现为在补体通路得分低的SLE患者中,凝血通路得分和lt SLEDAI的联系较弱,即在补体通路得分低的SLE患者中,lt SLEDAI在凝血通路得分低的SLE患者和凝血通路得分高的SLE患者之间的差值只有0.391,而这个差值在补体通路得分高的SLE患者中上涨到0.897。类似的,在凝血通路得分低的SLE患者中,补体通路得分和lt SLEDAI的联系较弱,即在凝血通路得分低的SLE患者中,lt SLEDAI在补体通路得分低的SLE患者和补体通路得分高的SLE患者之间的差值只有0.359,而这个差值在凝血通路得分高的SLE患者中上涨到0.805。在炎症反应得分低的SLE患者中,交互作用结果表明凝血通路得分和补体通路得分对lt SLEDAI的影响没有交互作用(P=0.406)结论SLE患者中,凝血通路和补体通路对疾病活动度有交互作用,这一作用在炎症反应激活的患者中更加明显。


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