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应用高效液相色谱仪串联高分辨质谱无创性鉴定人皮肤中神经酰胺

程莎莎  
【摘要】:研究背景皮肤中神经酰胺主要位于表皮,是表皮中的主要脂质,属于神经鞘脂类,一般由脂肪酸、鞘氨脂碱基二者结合而成。在表皮细胞中大约一半的脂质都是神经酰胺。目前表皮中已发现12种神经酰胺,与其他脂类共同参与表皮屏障功能的形成,在皮肤屏障中发挥着屏障、保湿、信号转导、免疫调节等功能。其含量的变化可能导致皮肤屏障功能受损,与一些皮肤疾病的发生或发展有着密切的联系,如特应性皮炎、银屑病等。研究神经酰胺为临床相关皮肤病的诊疗及新药的研发提供了理论依据和思路,因此近些年来神经酰胺的功能与作用机制越来越成为一个研究热点。研究目的本研究旨在通过无创性采集角质层,经过处理后对中国汉族健康人群的皮肤中神经酰胺进行检测分析,建立起皮肤中神经酰胺的定性以及定量分析的平台,即联合高效液相色谱仪、高分辨质谱,进行无创性检测角质层的神经酰胺。实验材料与方法实验对7个皮肤样品进行12种目标神经酰胺亚类定性,由于角质层神经酰胺是复杂多样的,无法获得所有神经酰胺亚类的标准品,因此本研究采用一种神经酰胺亚类标准品C42H85NO3定量表皮中相应神经酰胺的含量。应用氰基丙烯酸酯黏贴法取角质层皮肤样品,经过脂质溶解等一系列处理后,等待上机检测。采用赛默飞四极杆-静电场轨道阱高分辨FT质谱(thermo Q-Exactive),联合Ultimate3000高效液相色谱仪,BEH C18(100X2.1mm,1.7μm)色谱柱,柱温40°℃,流动相A=60:40 ACN/H2O+10mM NH4HCO2,0.1%HCO2H;B=90:10IPA/ACN+10mM NH4HCO2,0.1%HCO2H。反向色谱柱,流速为0.3ml/min,梯度洗脱。质谱检测中的离子源选用电喷雾式(ESI),Full Mass ddMS2模式,一级分辨率70000,二级分辨率17500。数据采集后用全流程脂质分析软件(LipidSearch)进行数据分析。结果实验对七种皮肤样品进行12种目标神经酰胺亚类半定量,可看出Q Exactive均能提到峰,且响应强度在10~5到10~7之间。对样品分别进行了正离子和负离子采集,LipidSearch软件进行搜库,7个皮肤样品中均含有12亚类神经酰胺,用神经酰胺C42H85NO3标准品去定量样品,测得样品的平均含量分别为:33.63、27.59、108.57、220.75、149.20、43.06、22.78μg/ml。除目标脂质外,正离子鉴定出高达300种以上其他脂质结果,以神经酰胺类和甘油三酯类为主;负离子鉴定出30种以上,均为神经酰胺类。结论神经酰胺作为重要的脂类,在皮肤中与其屏障功能密切相关。中国健康人群皮肤中神经酰胺含有12亚类,Q Exactive超高分辨液质联用及LipidSearch脂质组学软件可鉴定出表皮12亚类神经酰胺及其他脂质,高效灵敏,为后期健康或皮损表皮神经酰胺及其他脂类的定量分析奠定了基础,提供了简单快速的方法。在检测神经酰胺后发现,个体之间存在浓度差异。差异的原因可能与取材、处理及检测过程中不可避免的误差有关,也可能与皮肤屏障状态相关。


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