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《安徽医科大学》 2018年
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CP-25的外周血单个核细胞药动学研究及与P-糖蛋白的相互作用

赵茗毅  
【摘要】:类风湿关节炎(RA)是一种自身性免疫性疾病。免疫细胞在RA病程的不同阶段充当了重要角色,它们之间形成一个细胞-细胞相互作用的复杂网络,控制RA的发生与发展,包括释放炎症介质、诱导细胞增殖以及血管生成等。细胞药动学的研究已逐渐成为传统药动学的一个分支,并且越来越受到关注。药物通常通过被动转运或主动运输进入细胞,但同时又会被转运蛋白外排出细胞,转运蛋白的过表达是某些药物产生耐药性的主要原因,这往往会引起细胞中药动学性质的改变,降低药物在细胞中的累积量。多药耐药性(MDR)被普遍认为是导致肿瘤和感染性疾病患者治疗失败的一个重要原因。然而最近的研究发现这种现象也存在于RA这种自身免疫性疾病中。P-糖蛋白(P-gp)作为ABC转运超家族中的重要一员,与MDR密切相关,参与转运多种改善病情抗风湿药(DMARDs)。研究表明芍药苷(Pae)是P-gp的底物,同时Pae可以下调肿瘤细胞P-gp的表达。芍药苷-6-氧-苯磺酸酯(CP-25)作为一个新型活性单体化合物,免疫细胞是其发挥抗炎免疫调控作用的重要靶细胞。本所正在进行的研究发现CP-25可以和免疫细胞胞质中的GRK2相结合,抑制炎症相关信号通路的传导。因此研究CP-25在免疫细胞中的药动学有着重要的意义。同时CP-25作为Pae的结构修饰物,是否和Pae一样是P-gp的底物且能下调P-gp的表达,并且CP-25的治疗是否会产生MDR。基于以上研究背景,本实验通过建立UPLC-MS/MS分析方法,以外周血单个核细胞(PBMC)为研究对象,研究CP-25在PBMC的吸收和外排特性以及药物浓度-时间曲线。通过转运蛋白抑制剂确定CP-25是否是P-gp的底物。考察抑制和过表达P-gp对CP-25在PBMC中浓度的影响。采用Western blot和免疫组化等技术考察CP-25对PBMC和组织中P-gp的影响。为今后的药效学研究和联合用药提供一定的研究基础。目的:研究CP-25在PBMC的药动学及与P-pg的相互作用,为今后的药效学研究和联合用药提供一定的研究基础。方法:1)建立CP-25和Pae大鼠血浆和PBMC样品的UPLC-MS/MS分析方法。2)检测PBMC转运CP-25和Pae的药物量,同时考察浓度、时间和温度对CP-25和Pae转运的影响。单次灌胃给药后,检测CP-25和Pae在血浆和PBMC中的浓度。单次和多次灌胃给药后,检测血浆和PBMC中的CP-25浓度,考察血浆与PBMC中浓度的相关性。单次和多次灌胃给药后,检测正常和佐剂性关节炎(AA)大鼠PBMC中的CP-25浓度,考察AA对PBMC中CP-25浓度的影响。3)检测PBMC外排CP-25的药物量,同时考察时间、转运蛋白抑制剂和过表达的P-gp对CP-25外排的影响。Western blot法和Rh123蓄积实验法分别检测CP-25对TNF-α刺激的PBMC P-gp表达与功能的影响,并考察PBMC P-gp表达量与PBMC中CP-25浓度的关系。4)AA大鼠于给药治疗的不同阶段,Western blot法检测PBMC P-gp的表达,UPLC-MS/MS检测当天给药后3和6 h PBMC中CP-25的浓度。治疗结束后,取大鼠脑、肝脏、心脏、肾脏、脾脏、胃、小肠、结肠和肺组织,采用免疫组织化学染色法对各组织P-gp的表达进行定位,并用Image-pro Plus图像处理软件对P-gp的表达进行半定量分析。结果:1)血浆样品中CP-25和Pae的线性范围是10-800 ng/m L;PBMC样品中CP-25的线性范围是0.4~5 ng/m L,Pae的线性范围是5~20 ng/m L。方法学结果表明,两套方法学的精密度和准确度、回收率和基质效应、稳定性均符合生物样品检测和分析的规定和要求。所建立的两套方法学均可以满足当前的实验要求。2)PBMC对不同浓度CP-25和Pae的转运量均随着时间的增加而逐渐减少,在1 h后达到动态平衡。同时转运体系温度在37℃时,CP-25和Pae的转运量分别较4℃时无显著性差异。正常大鼠单次给药(100 mg/kg)3 h后,血浆中CP-25的浓度为Pae的1.33倍,PBMC中CP-25的浓度为Pae的1.94倍。正常大鼠多次给药(50mg/kg)后,PBMC中的CP-25浓度与血浆中CP-25浓度变化的幅度相似;正常大鼠单次给药(50 mg/kg)后,PBMC中的CP-25浓度与血浆中CP-25浓度的平均比值为71.05%(范围是45.42%至89.99%),PBMC和血浆中的CP-25的浓度具有相关性(r=0.814,P0.001)。单次给药(50 mg/kg)后,AA大鼠的AUC(0-∞)和MRT(0-t)明显低于正常大鼠(AUC(0-∞):154.663±20.775 vs 199.752±36.955 ug/L*h,P0.05;MRT(0-t):3.129±0.064 vs 3.362±0.092 h,P0.01);多次给药(50 mg/kg)后,AA大鼠的AUC(0-t)和MRT也明显低于正常大鼠(AUC(0-t):113.517±19.856 vs136.866±21.391 ug/L*h,P0.01;MRT(0-t):2.047±0.179 vs 3.077±0.053 h,P0.01;MRT(0-∞):4.124±0.796 vs 7.576±2.480 h,P0.05)。3)PBMC对CP-25的外排量在前30 min内随着时间的增加而增加,成线性,30 min后外排量逐渐减少。维拉帕米能显著增加CP-25在PBMC中的浓度。三种P-gp抑制剂均能显著减少PBMC外排CP-25的药物量,且在一定浓度范围内外排的药物量随着抑制剂的浓度增加而减少。TNF-α刺激的PBMC对CP-25的外排作用明显增强。外排30 min后,TNF-α刺激的PBMC中CP-25的浓度不到正常PBMC的一半,与正常PBMC外排60 min后的浓度无显著性差异。同时TNF-α刺激的PBMC中CP-25的起始浓度就显著低于正常PBMC。CP-25能抑制TNF-α刺激的PBMC P-gp的表达和功能,并有时间和浓度依赖性。CP-25作用TNF-α刺激的PBMC,随着作用时间的增加,CP-25在PBMC中的浓度有增长的趋势,作用24 h比作用2 h有显著性差异,但与作用36 h无显著性差异。4)从给药治疗第4天起到治疗结束,CP-25可以逐步降低AA大鼠PBMC P-gp的表达,且具有剂量依赖性。从给药治疗(50 mg/kg)第12天起,给药后6 h AA大鼠PBMC中的CP-25浓度相比第一天有显著升高,给药后3 h的CP-25浓度至治疗结束时都未表现出显著的升高或降低。但从第8天起,给药后6 h与3 h CP-25浓度的比值相比第一天有所升高,至第12天起有显著性差异。P-gp在所检测的组织中均有表达。AA和CP-25均未对大脑中的毛细血管,脾脏,胃,结肠,心脏和肺的P-gp表达产生影响。但AA可以导致大脑中的血管,肝细胞和胆小管,小肠上皮细胞P-gp表达升高,肾脏中近端和远端小管P-gp表达降低。CP-25可以调节P-gp在组织中的异常表达,其中100和50 mg/kg剂量组最为明显。结论:1.CP-25和Pae在PBMC上的跨膜转运属于被动转运,PBMC对CP-25的吸收好于Pae;2.大鼠体内PBMC与血浆中的CP-25浓度具有关联性,AA会降低CP-25在PBMC中的AUC和MRT;3.P-gp参与PBMC对CP-25的外排,CP-25能降低PBMC P-gp的表达和功能并增加自身在PBMC中的浓度;4.CP-25能调节AA大鼠PBMC和组织中异常表达的P-gp。
【学位授予单位】:安徽医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R593.22

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