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《安徽医科大学》 2006年
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血液细胞靶向性腺病毒载体的构建及功能检测

倪芳  
【摘要】:目前基因转运方法很多,其中包括物理方法、化学方法、融合法、基因枪等。上述基因转移方法各有优点,但共同问题是基因转移效率低,较难获得稳定表达的细胞。腺病毒载体由于具有宿主范围广、能制备高滴度病毒、感染效率高、高表达目的基因、能感染增殖及静止两类细胞、不与宿主细胞基因组DNA结合、容许插入大片段外源基因等特点而受到人们的青睐。 多数用于基因转移的腺病毒载体都来自于5型或2型腺病毒(Ad5和Ad2),但很多血液系统来源的细胞对腺病毒感染具有天然的抵抗性,因此限制了该载体在造血研究领域的应用。腺病毒纤维蛋白在腺病毒黏附到靶细胞的过程中起关键作用,不同腺病毒亚型可能会具有不同的组织或细胞趋向性,因为它们的纤维蛋白会识别不同的细胞表面受体。血液细胞表面具有B组腺病毒Ad11p的高效结合受体,可以通过对5型腺病毒载体进行纤维改造,使其具有B组腺病毒的趋向性,从而增强对血液细胞的基因转移效率。 本研究以AdEasy系统为基础,先用递归PCR的方法人工合成人B组11p型腺病毒的部分纤维(fiber)基因,测序正确后,经过多次的酶切连接操作,将其替换AdEasy骨架质粒中的人5型腺病毒的fiber基因,得到新的腺病毒骨架质粒命名为AdEasy-1/F11p,应用带有绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)报告基因的穿梭质粒pShuttle-GFP与AdEasy-1/F11p腺病毒DNA在BJ5183细菌内进行同源重组得到重组腺病毒质粒,切取重组腺病毒基因组DNA,脂质体转染法将其转运到293包装细胞内获得重组腺病毒,命名为Ad5F11p-GFP。同时以GFP监测腺病毒载体包装、扩增及滴度测定。为了检测改建后的重组腺病毒感染血液细胞的能力,以Ad5-GFP作对照,应用纯化后的重组腺病毒感染白血病细胞系、原代白血病细胞以及脐带血来源的CD34~+造血干细胞,流式细胞仪检测GFP的表达。结果显示这种改建后的重组腺病毒能靶向结合血液细胞,其转染血液细胞的能力明显提高,显示出很好的应用前景。
【学位授予单位】:安徽医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R346

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