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hHBrk1对肺癌细胞生物学行为的影响及其与WAVE1相互作用的初步研究

虞红珍  
【摘要】: hHBrk1是本实验室应用抑制性消减杂交技术从人支气管上皮恶性转化细胞系BERP35中克隆到的差异表达基因,因与玉米的Brick1有高度同源而命名(human homology of Brick1 , hHBrk1)。位于3号染色体短臂25.3-24.1区,由3个外显子和2个内含子构成,编码75个氨基酸残基,分子量约9 kD。其编码蛋白又名HSPC300、C3ORF10及MDS027。生物信息学分析hHBrk1在动植物界高度保守,在第47~67位氨基酸残基存在一七重复(heptaed repeat, HR)结构域,此结构域可形成特殊的卷曲螺旋(coiled coil),是介导蛋白质相互作用的重要结构之一。 我们的前期研究结果表明:hHBrk1基因在正常成人组织中均有表达;在肺癌组织中的表达丰度高于相应的癌旁组织。定位于肺癌细胞95D的胞浆,在细胞运动的最前沿富集,并与微丝共定位。GST pull-down assay结合肽指纹质谱术,首次发现hHBrk1是myosin VI的“伴侣”分子,而Myosin VI在肿瘤细胞迁移中起着重要作用。这些都提示hHBrk1为一微丝相关新基因,与肿瘤的浸润转移密切相关。 而当前的各种研究表明hHBrk1是促微丝聚合因子WAVE五聚体复合物的成员之一,通过对保护WAVE蛋白的稳定来调控微丝聚合、参与细胞运动及胞内物质运输等基础生命活动。WAVE蛋白家族以复合物形式存在,是微丝聚合的核心蛋白;当外界环境刺激激活Rac,后者通过Nck连接蛋白结合,使WAVE蛋白变构活化,活化的WAVE蛋白与HSPC300结合形成具有活性的亚二聚体,促使WAVE蛋白以依赖Arp2/3复合物的方式参与微丝聚合。但hHBrk1/HSPC300与WAVE蛋白的相互作用位点尚未明确。本论文在前期研究结果的启示下,在hHBrk1表达抑制后对肺癌细胞生物学特性的影响及其编码蛋白与WAVE1的相互作用进行了初步探讨。取得了如下主要进展: 1 hHBrk1基因沉默对肺癌细胞生物学特性的影响 1)利用RNA干扰技术(siRNA),成功的使hHBrk1基因表达下降,获得了hHBrk1表达沉默的稳定细胞模型。 2)大细胞肺癌95D细胞在hHBrk1表达抑制后,其细胞的增殖能力、细胞周期及细胞凋亡均无明显变化,但细胞的迁移能力明显下降。说明hHBRK1可能不参与增殖分化相关的生命活动,但hHBRK1参与细胞运动,可能与肿瘤细胞的浸润转移相关。 3)显微镜下观察hHBrk1沉默细胞和对照细胞,发现hHBrk1沉默细胞形态明显的要大,胞膜薄,形态不规则,伸出的伪足减少,伪足长度变短等改变。对各亚细胞器的标记,hHBrk1表达抑制后,微丝在细胞运动前沿富集减少,但在对高尔基体、溶酶体、内质网的标记无明显变化;hHBrk1基因沉默后的细胞形态学的表现,与细胞微丝的聚合减少是相一致的。 4) Western blotting检测MAPK信号通路各蛋白的变化,发现hHBrk1沉默后,磷酸化的Erk1/2含量降低,这与该细胞的迁移能力下调是相一致的,表明hHBrk蛋白可能通过Erk1/2通路增强肿瘤细胞的迁移能力。而磷酸化的JNK和P38增强,表明该细胞对应激刺激的能力增强。 2 hHBrk1与WAVE1蛋白的相互作用位点的鉴定 利用免疫共沉淀技术,发现hHBrk1和WAVE1蛋白存在相互作用,为了探讨相互作用位点,我们分别构建了不同功能域的表达载体,再次进行免疫共沉淀,发现hHBrk1与WAVE蛋白的SHD功能域(WAVE蛋白同源区域)相互结合。反之,利用WAVE蛋白与带GST标签的hHBrk1及其各缺失体融合蛋白均匀混合,免疫共沉淀结果显示WAVE蛋白与hHBrk1的羧基端(即hHBrk1的HR结构域)相结合。 本课题研究初步发现hHBrk1参与细胞的迁移,并且可能经MAPK信号转导通路介导;hHBrk1的HR结构域与WAVE1的SHD可能存在相互作用。为深入探讨hHBrk1在肿瘤浸润转移中的作用机制及该基因是否可能成为肺癌潜在治疗靶标提供有力的实验依据。


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