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《安徽医科大学》 2008年
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骨髓间充质干细胞对实验性自身免疫性重症肌无力的影响和机制

王嵘峰  
【摘要】: 目的: 1.建立从Lewis大鼠骨髓中分离、培养间充质干细胞的方法,并对分离、培养的间充质干细胞进行鉴定。 2.研究鼠源乙酰胆碱受体α亚基97-116 (Rα97-116)诱导实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)动物模型的可能性,为MG的基础研究提供简便实用的动物模型。 3.研究骨髓间充质干细胞对实验性自身免疫性重症肌无力临床和免疫功能的影响和机制,为MG的细胞移植治疗提供实验和理论依据。 方法: 采用全骨髓培养法从Lewis大鼠骨髓中分离培养骨髓间充质细胞,经贴壁法体外扩增、传代和流式细胞仪鉴定MSCs。采用人工合成的Rα97-116肽段与完全弗氏佐剂(CFA)充分乳化后多点皮下注入6-8周龄雌性Lewis鼠,并在第30、60天强化注射与不完全弗氏佐剂(IFA)充分混合后的等量肽段构建EAMG。对照组同期注入等量磷酸缓冲液(PBS)。通过观察实验鼠体重变化,并进行Lennon临床评分;通过低频重复电刺激检查电衰减反应和ELISA法检测血清AchR-Ab滴度变化来确定EAMG是否成模。第三次免疫后一周后,将20只成模的EAMG鼠随机分为移植治疗组和EAMG对照组,分别给予MSCs 1×106/100μLPBS尾静脉回输,EAMG对照组给予100μLPBS。自移植之日起,每日同一时间对移植组与EAMG对照组大鼠称重和Lennon临床评分。移植后第二周检测两组血清AchR-Ab,移植后第三周流式细胞仪检测移植组、EAMG对照组以及同周龄健康Lewis大鼠CD28、CTLA4、CD25在各组外周血CD4+T淋巴细胞中的表达。 结果: 1.原代培养的MSCs于24h后贴壁,48~72h形成集落,7~10d可达到70%~80%融合。第5代MSCs有97.5%表达CD90抗原, 1.72%表达CD45抗原。 2.EAMG组中70%Lewis鼠Lennon临床评分在1级以上,3、5Hz低频重复电刺激阳性电衰减反应D5﹥10%,血清AchR-Ab滴度与正常对照血清比值2.1。证实了实验动物EAMG成模率达70%。 3.经MSCs移植治疗15天后,治疗组EAMG大鼠体重较对照组大鼠明显增加,具有统计学意义(p﹤0.05)。 4.经MSCs移植治疗13天后,治疗组EAMG临床评分下降,与对照组比较具有统计学意义(p﹤0.05)。 5.经MSCs移植治疗两周后,治疗组AChR-AbIgGOD值(0.88±0.32)明显下降,与对照组(1.36±0.26)比较有统计学意义(p﹤0.05)。 6.经MSCs移植后第三周,治疗组CD4+T淋巴细胞表面CD28表达已低于对照EAMG组(p0.05),并且与健康组无统计学意义的差别(p0.05),EAMG大鼠CD28表达较正常健康组有所上升(p0.05)。治疗组CD4+T淋巴细胞表面CTLA-4表达均显著高于对照EAMG组和健康组(p0.01), EAMG大鼠CTLA-4表达较正常健康组有所上升(p0.05)。治疗组CD4+CD25+调节T细胞比率较对照EAMG组和健康组显著升高(p0.01), EAMG大鼠CD4+CD25+调节T细胞较正常健康组无统计学意义上的差别(p0.05)。 结论: 1.贴壁筛选培养法能够成功分离、纯化以及扩增得到细胞治疗实验所需要的MSCs。 2.用人工合成鼠源肽段R97-116免疫Lewis鼠可成功诱导EAMG模型,为MG的研究奠定了基础。 3. MSCs移植可以有效地减轻EAMG的症状,降低AChR-Ab滴度,是一种简便可行的干预方法。MSCs的作用机制可能与其抑制CD28共刺激分子表达,上调CD4+CD25+CTLA-4+T细胞比率有关。
【学位授予单位】:安徽医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R746.1

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【参考文献】
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