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丹参酮ⅡA抗胆管癌细胞增殖的实验研究

齐伟  
【摘要】: 胆管癌是肝胆道系统中第二大恶性肿瘤,仅次于肝细胞癌,临床上出现症状较晚,早期诊断困难,而且由于胆管癌所处的解剖位置特殊及其向周围组织、血管、神经浸润的特点,外科根治性切除率低,加上胆管癌对放、化疗均不敏感,因而预后较差。近年来,胆管癌的发病率与死亡率逐年上升,占肝胆系统恶性肿瘤的10%~15%。因此,深入研究胆管癌发病机制,并寻求有效的新的治疗方法,对于提高胆管癌的临床治疗具有十分重要的意义。复方丹参是中医常用的活血化瘀药,其主要成分为丹参酮、丹参新醌、丹参素等。近年来研究表明,丹参酮具有扩张冠状动脉血管、降低血液粘度、抗血小板、抗感染,改善心、肺、脑、肝的缺血再灌注损伤及调节免疫应答等药理作用,丹参酮ⅡA(Tanshinone,TanⅡA )作为中药丹参的提取一种脂溶性成分,对多种肿瘤细胞具有细胞毒作用、诱导分化和调亡,目前研究表明丹参酮ⅡA对人肺癌、卵巢癌、肝癌、胃癌等人实体肿瘤细胞以及人早幼粒白血病具有抑制作用。本实验通过丹参酮ⅡA作用于体外培养的人肝内胆管癌细胞株HCCC-9810,研究丹参酮ⅡA对胆管癌细胞的生长抑制作用及其可能作用机制,为胆管癌的防治探索新依据。 目的研究丹参酮ⅡA对人胆管癌细胞系HCCC-9810增殖的抑制作用,并进一步探讨其作用机理。 方法胆管癌细胞株HCCC-9810于体外培养,每日倒置显微镜下观察细胞生长情况。应用不同浓度丹参酮ⅡA处理细胞,与作用的不同时间收集细胞,采用MTT比色法、肿瘤细胞计数、集落形成实验探讨丹参酮ⅡA对胆管癌细胞株HCCC-9810的增殖是否有抑制作用,荧光显微镜观察丹参酮ⅡA处理后细胞的形态学变化,流式细胞术检测凋亡及细胞周期分析,透射电镜、琼脂糖凝胶电泳测DNA ladder证实凋亡的存在;应用RT-PCR检测PCNA /bcl-2 /bax/survivin基因的表达变化,采用SP免疫组化染色观察药物处理前后bcl-2 /bax/survivin蛋白的表达情况。 结果(1) MTT显示丹参酮ⅡA明显抑制体外培养的HCCC-9810细胞的增殖,并随着浓度的增加和时间的延长而增强,通过计算得出丹参酮ⅡA作用于HCCC-9810细胞半数抑制浓度为6.25μg/ml,达62.7%,各组细胞集落形成率分别为73.6%、22.9%。(2)丹参酮ⅡA作用72小时后荧光显微镜/透射电镜下可见HCCC-9810细胞呈现典型的凋亡特征:细胞核染色质致密浓缩,凋亡小体形成等,DNA ladder测定可见DNA梯状电泳条带。(3)流式细胞术显示,随药物浓度增加,细胞凋亡率显著增加, 10μg/ml丹参酮ⅡA作用72小时后,可见典型的亚二倍体凋亡峰(4)免疫组化和RT-PCR测定显示随着丹参酮ⅡA浓度增加,bcl-2、survivin表达下调,而bax表达上调,表明bcl-2、bax、survivin等凋亡相关基因可能参与了丹参酮ⅡA诱导的HCCC-9810细胞凋亡过程。 结论(1)丹参酮ⅡA对体外培养的胆管癌细胞株HCCC-9810的生长和增殖有抑制作用,呈剂量依赖性和时间依赖性。(2)丹参酮ⅡA通过诱导细胞凋亡从而抑制胆管癌细胞生长和增殖,bcl-2、bax、survivin等凋亡相关基因可能参与了丹参酮ⅡA诱导的HCCC-9810细胞凋亡过程。


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