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《安徽医科大学》 2009年
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骨髓间充质干细胞对实验性自身免疫性重症肌无力Th1/Th2的影响及机制

罗六一  
【摘要】: 目的: 1.建立从Lewis大鼠骨髓中分离、培养间充质干细胞(MSCs)的方法,并对分离、培养的MSCs进行鉴定。 2.研究鼠源乙酰胆碱受体α亚基97-116 (Rα97-116)诱导实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)动物模型的可能性,为重症肌无力(MG)的基础研究提供简便实用的实验动物模型。 3.通过研究转录因子T-bet和GATA-3在EAMG中的表达,探讨其在EAMG发病机制中的作用。 4.研究骨髓MSCs对EAMG临床和免疫功能的影响,为MG的细胞移植治疗提供实验和理论依据。 方法: 采用全骨髓培养法从Lewis大鼠骨髓中分离培养骨髓MSCs,经贴壁法体外扩增、传代和流式细胞仪鉴定MSCs。采用人工合成的Rα97-116肽段与完全弗氏佐剂(CFA)充分乳化后多点皮下注入6-8周龄雌性Lewis大鼠,并在第30、60天强化注射与不完全弗氏佐剂(IFA)充分混合后的等量Rα97-116肽段,制备EAMG大鼠模型。对照组实验大鼠同期则注入等量磷酸缓冲液(PBS)。通过观察Lewis大鼠免疫接种前后体重的变化,并进行Lennon临床评分;通过低频重复电刺激(RNS)检查电衰减反应和ELISA法检测血浆抗乙酰胆碱受体(AChR)抗体滴度变化来确定EAMG是否成模。将20只成模鼠按随机对照原则分为细胞移植组和模型对照组各10只,并设置10只健康同周龄Lewis大鼠为正常对照组。收集表型鉴定后的MSCs,计数后离心,使用PBS重悬,调整细胞密度为1×106/100μL PBS。移植时间选在第三次免疫后第一周始。细胞移植组经尾静脉输入MSCs悬液100μL,模型对照组和正常对照组同期则给予100μL PBS。自移植之日起,每日同一时间对细胞移植组和模型对照组大鼠称重,并使用盲法对二组大鼠进行Lennon临床评分。移植后第二周检测两组大鼠血浆中AChR-Ab含量,并于移植后第三周采用RT-PCR法及ELISA法分别检测细胞移植组、模型对照组以及正常对照组大鼠PBMCs中T-bet、GATA-3以及血清IFN-γ、IL-4表达情况。 结果 1.原代培养的MSCs于24h后贴壁,48~72h形成集落,7~10d可达到70%~80%融合。第5代MSCs有97.5%表达CD90抗原, 1.72%表达CD45抗原。 2. EAMG组中约70%的Lewis大鼠Lennon临床评分1级,3、5Hz低频重复电刺激阳性电衰减反应D5﹥10%,血浆中AChR-Ab滴度与正常对照比值2.1。证实了实验动物EAMG成模率达70%。 3.经MSCs移植治疗15天后,细胞移植组大鼠体重较模型对照组明显增加,具有统计学意义(p﹤0.05)。 4.经MSCs移植治疗13天后,细胞移植组大鼠临床评分下降,与模型对照组比较具有统计学意义(p﹤0.05)。 5.经MSCs移植治疗两周后,细胞移植组AChR-AbIgG OD值(0.88±0.32)含量明显下降,与模型对照组(1.36±0.26)比较有统计学意义(p﹤0.05)。 6.经MSCs移植后第三周,细胞移植组和模型对照组PBMCs中,T-bet的表达量分别为(0.67±0.13)和(0.85±0.16),两组比较具有显著差异性(P0.01);而正常对照组为(0.66±0.14),与细胞移植组无统计学意义(P0.01);GATA-3的表达量分别为(0.51±0.11)和(0.70±0.09),差异也具有显著性(P0.01);而正常对照组为(0.45±0.13),与细胞移植组无统计学意义(P0.01);血清中IFN-γ的含量,细胞移植组(113.24±16.93)pg/ml明显低于模型对照组(231.71±44.44)pg/ml(P0.01);而正常对照组为(110.09±18.94)pg/ml与细胞移植组无统计学意义(P0.01);细胞移植组IL-4含量(90.72±4.19)pg/ml明显低于模型对照组(97.38±4.21)pg/ml(P0.01);而正常对照组为(87.11±3.60)pg/ml与细胞移植组也无统计学意义(P0.01);模型对照组大鼠T-bet表达与IFN-γ及GATA-3表达与IL-4均呈显著正相关(r=0.87,P0.01;r=0.89,P0.01)。 结论 1.贴壁筛选培养法能够成功分离、纯化以及扩增获得细胞治疗实验所需要的MSCs。 2.用人工合成鼠源肽段Ra97-116免疫Lewis鼠可成功诱导制备出EAMG模型,为MG的基础研究奠定了基础。 3.T-bet和GATA-3在EAMG大鼠PBMCs中表达均显著增高,这可能是EAMG大鼠细胞和体液免疫反应增强的重要原因之一。 4.MSCs移植可以有效地减轻EAMG的症状,降低AChR-Ab滴度,是一种简便可行的干预方法。MSCs的作用机制可能与其抑制T-bet和GATA-3的表达,从而影响Thl和Th2细胞的异常分化及其细胞因子的产生,进而下调AChR特异性T和B细胞的异常免疫应答有关。
【学位授予单位】:安徽医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R746.1

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