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Phb1与CLIC1相互作用的初步研究

邢昕  
【摘要】: 目的酵母双杂交技术证实phb1与CLIC1在酵母中的相互作用;构建带FLAG标签的phb1真核表达载体和带GFP标签的CLIC1真核表达载体;将其共转染至COS7细胞,观察其在哺乳细胞株内的共定位的具体情况;转染至HEK293T细胞,进行免疫共沉淀,检测在哺乳动物细胞内phb1蛋白与CLIC1蛋白能否相互结合。 方法以含人phb1全长cDNA序列的质粒pLenti6-phb1为模板,用PCR方法扩增phb1全长序列,双酶切后回收目的片段,连接到载体pGADT7上,构建酵母表达载体pGADT7-phb1;双酶切pGADT7-phb1回收目的片段,连接到载体pGBKT7上,构建载体pGBKT7-phb1;以pACT2-CLIC1为模板,用PCR方法扩增CLIC1全长序列,BamHⅠ单酶切回收目的片段,连接到pGBKT7上,构建酵母表达载体pGBKT7-CLIC1和pGADT7-CLIC1。把测序正确的酵母表达载体分组转化至酵母菌AH109,在SD/-Leu/-Trp/-His/+3-AT/X-α-gal盘上筛选蓝色的克隆。呈蓝色的克隆是α-gal活性为阳性的克隆,再通过滤膜印迹实验测定β-半乳糖苷酶活性进一步验证它们的相互作用情况。 用PCR方法扩增phb1全长序列构建真核表达质粒pCDNA3-FLAG-phb1,后转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其在细胞的定位;将构建正确的质粒pCDNA3-FLAG-phb1和pCDGFP-CLIC1共同转染至COS7细胞,通过免疫荧光显微镜观察phb1蛋白和CLIC1蛋白在细胞内的共定位情况;将质粒pCDNA3-FLAG-phb1和pCDGFP-CLIC1共同转染至HEK293T细胞,提取细胞裂解液,进行免疫共沉淀,后通过Western blot检测在哺乳动物细胞内phb1蛋白与CLIC1蛋白能否结合。 结果经酶切和测序鉴定,各组质粒均构建正确。营养筛选及α,β-半乳糖苷酶活性的测定均表明phb1和CLIC1能相互作用;pCDNA3-FLAG-phb1和pCDGFP- CLIC1转染至COS7细胞中,免疫荧光显微镜观察phb1和CLIC1共定位于细胞核周围区域;免疫共沉淀和Western blot检测证明phb1蛋白和CLIC1蛋白在HEK293T细胞中相互结合。 结论酵母双杂交系统3初步证实phb1和CLIC1之间存在相互作用;免疫荧光显微镜观察pCDNA3-FLAG-phb1和pCDGFP-CLIC1在COS7细胞中存在共定位,主要聚集于胞质中;免疫共沉淀和Western blot检测进一步证明phb1蛋白和CLIC1蛋白在哺乳动物细胞中相互结合。


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