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《安徽医科大学》 2010年
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利用孕妇外周血中胎儿有核红细胞行无创性产前诊断的初步研究

张荣  
【摘要】: 目的:探索运用支持胎儿有核红细胞生长和分化的双相液态培养体系进行孕妇外周血中胎儿有核红细胞培养的可行性。 方法:(1)从12例人工流产后绒毛中收集单核细胞进行Wright's染色和ε-链免疫荧光抗体标记,观察FNRBC进行计数和分类。 (2)建立双相液态培养法行胎儿有核红细胞体外培养,即从10例7-9周的孕妇外周血中分离单核细胞,在第一相培养基中培养4-5天后收集不粘聚的细胞,再种植在第二相培养基中培养3-4天。显微镜下观察活细胞生存状态。 结果:(1)ε-链免疫荧光抗体标记后在荧光显微镜下观察绿染的FNRBC,Wright's染色发现各个期别的红细胞,其中有分裂增殖能力红细胞占39.08%。 (2)第一相培养基中培养3-4天后单核细胞绝大多数死亡,连续观察10-14天,细胞全部死亡。 结论:(1)绒毛组织中存在有分裂增殖能力红系细胞,可望通过细胞培养得到扩增,但实验仍需进一步验证。 (2)据实验结果分析,目前培养条件下孕妇外周血中的FNRBC尚不能得到有效扩增,提示外周血中FNRBC培养条件目前尚不充分,培养体系的建立与稳定尚待进一步探索、验证。若通过改善培养条件或者寻找新的可扩增种类胎儿细胞,实现一个临床上满意的、可接受的无创产前诊断还是具有一定可能性。 目的:本文旨在建立一种利用孕妇外周血中分选出的胎儿有核红细胞进行无创伤性产前诊断的有效方法。方法:1:10例妊娠7-9周人流妇女绒毛一枚及外周血20mL。 2:人流后绒毛常规PCR检测sry/zfx基因片段确定胎儿性别。 3:pereoll双密度梯度离心初步分离孕妇外周血中单核细胞、抗CD71.PE(A组)、抗-CD45PerCP (B组)或血红蛋白ε链免疫荧光抗体(C组)标记单核细胞,流式细胞仪进行分选,将分选出的细胞甩在玻片上。 4:抗-CD45和血红蛋白ε链免荧光抗体双标单核细胞,流式细胞仪进行分选CD45dim细胞。流式分选的CD45dim细胞置荧光显微镜下显微操作法挑选出ε-链免疫荧光抗体阳性的NRBCs。 5:显微操作挑选出的ε-链免疫荧光抗体阳性细胞采用单细胞多重置换扩增技术(MDA)进行全基因组扩增。 6:利用全基因组扩增产物为模板,常规PCR检测Alphoid基因片段确定胎儿性别,与绒毛PCR性别比较。 结果:1:经流式分选的阳性信号的百分比、信号数、甩在玻片上的细胞分别为A组为0.305±0.051%,6500±2000个/1Oml、4±3个/10ml;B组为0.781±0.051%、10000±3000个/10ml、20±8个/10ml;C组为0.007±0.002%、2500±1500个/10ml、0个/10ml。三组间有统计学差异,其中B组细胞收获率最高,C组最低。 2:血红蛋白ε链免疫荧光抗体、CD45双标记的5例标本流式细胞仪分选CD45dimx细胞后所有标本均观察到血红蛋白ε链阳性细胞,即胎儿有核红细胞(FNRBC)。 3:绒毛PCR检测sry/zfx基因片段确定为男性胎儿有2例女性3例, 4:怀2例男性和1例女性孕妇外周血分选出的阳性细胞经全基因组扩增和后续常规PCR Alphoid基因片段扩增显示1例全基因组扩增失败;1例诊断为男胎,1例为女性与绒毛PCR性别结果完全符合。 结论:1:Percoll双密度梯度离心法从孕妇外周血中富集单个核细胞,经CD45标记流式仪分选细胞收获率最高、血红蛋白ε链免疫荧光抗体标记的最低; 2:ε-抗体、CD45双标,CD45dim细胞流式分选后结合显微操作技术从母血中挑选出ε-血红蛋白阳性细胞,经全基因组扩增可以有效地获取足够量的研究模板,保证后续分析的准确性,在临床上可应用于性连锁遗传疾病的无创性产前诊断。
【学位授予单位】:安徽医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R715

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