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《安徽医科大学》 2010年
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黄芪总苷对糖皮质激素和β-淀粉样蛋白协同诱导神经元损伤的保护作用及其机制研究

李维祖  
【摘要】: 背景 阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种常见于老年人的神经系统退行性疾病。临床上表现为隐袭起病、不可逆进行性发展的记忆减退,认知功能下降,行为异常和社交障碍等,给家庭和社会带来巨大的负担。随着我国进入老龄化社会,AD患者将会越来越多。因此,研究AD的发生发展机制,寻找防治AD的药物具有重要的意义。 阿尔茨海默病的发病原因目前还不完全清楚,可能是基因突变、环境和内分泌等众多复杂因素相互作用的结果。近年来,紧张的生活方式,外源性糖皮质激素过度暴露等与AD的发生和进展逐渐受到人们的重视。慢性应激和糖皮质激素水平的升高可以促进海马神经元的损伤,导致HPA轴调节功能失调并进一步加重海马的损伤,形成一种恶性循环。临床试验也证实,随着年龄的增加血浆糖皮质激素基础水平增加,在患有AD的老年人比没有痴呆的老年人具有更高的糖皮质激素水平。因此糖皮质激素作为血浆中的参与应激的激素与老年性痴呆的发病具有密切相关性。 阿尔茨海默病的特征性病变是老年斑,Aβ是老年斑的特征性成分,也是形成的主要物质基础。Aβ具有细胞毒性作用,能增强或放大各种伤害性刺激对神经细胞的损伤。研究发现慢性应激和外源性糖皮质激素暴露均可导致转基因AD模型小鼠脑组织Aβ生成增加,促进Aβ沉积和老年斑的形成。因此研究糖皮质激素和Aβ协同作用对神经元的损伤及其在AD发生和发展中的作用具有重要意义。 黄芪是传统抗衰老中药,具有补中益气、扶正固本和促智等功效。黄芪总苷(Astragalosides,AST)是从黄芪中提取的有效部位,具有抗炎、免疫调节、促智、抗衰老和神经保护作用。临床常用于防治心脑血管疾病、促智、延缓衰老、免疫功能紊乱性疾病和抗肿瘤等多种疾病。本课题在前期研究的基础上,进一步研究糖皮质激素和Aβ对神经元的损伤作用及在AD发病中的作用,同时研究黄芪总苷对糖皮质激素和Aβ诱导神经元损伤的保护作用及其机制。 方法与结果 第一部分黄芪总苷对糖皮质激素诱导小鼠学习记忆损伤的保护作用及其机制 本实验采用地塞米松(DEX, 5mg/kg,ig 21d)诱导12月龄小鼠学习记忆障碍和神经元损伤,用自主活动仪测定造模后第10天和第20天小鼠的自主活动;采用Morris水迷宫观察小鼠的学习记忆功能;采用HE染色观察小鼠脑组织病理形态学变化;采用Hoechst 33258染色荧光显微镜观察脑组织皮层和海马CA1、CA3区神经元凋亡;采用RT-PCR检测小鼠脑组织中β淀粉样前体蛋白(APP)、α-分泌酶、β-分泌酶,Caspase-3 mRNA的表达水平;采用免疫组化检测小鼠脑组织APP、细胞色素c和Caspase-3的表达水平;采用Ac-DEVD-pNA和Ac-LEHD-pNA裂解法测定小鼠脑组织Caspase-3和Caspase-9的活性。 实验结果显示,DEX能减少小鼠自主活动,AST40mg/kg组在造模后第10天能增加小鼠的自主活动;水迷宫结果显示,DEX能减少小鼠在平台象限游泳时间和穿过平台次数,人参皂苷Rg1和AST20、40mg/kg能增加小鼠在平台象限的游泳时间,人参皂苷Rg1和40mg/kg能增加小鼠穿过平台的次数。HE染色和Hoechst 33258染色结果显示,DEX能导致脑组织海马CA1、CA3区和皮层神经元损伤和凋亡,AST对神经元的损伤和凋亡有一定的改善作用。RT-PCR分析显示,DEX能增加APP695、APP751,β-分泌酶和Caspase-3 mRNA的表达减少α-分泌酶mRNA表达。AST (20,40 mg·kg- 1 )和人参皂苷Rg1可降低DEX诱导升高的APP695、APP751,β-分泌酶和Caspase-3 mRNA水平,升高α-分泌酶mRNA水平。免疫组化结果显示,DEX可增加小鼠脑组织皮层和海马CA1、CA3区APP、细胞色素c和Caspase-3表达,AST和Rg1能不同程度减少APP、细胞色素c和Caspase-3表达量。DEX能升高小鼠脑组织caspase-3、caspase-9活性, AST20、40mg/kg组小鼠脑组织caspase-3、caspase-9的活性有一定的降低作用。 第二部分黄芪总苷对糖皮质激素和Aβ协同诱导大鼠学习记忆损伤的保护作用及其机制研究 本实验采用Aβ25-35双侧海马CAl区注射同时灌胃地塞米松(DEX)14天建立大鼠学习记忆损伤模型,采用Morris水迷宫检测大鼠学习记忆功能;采用HE染色观察大鼠脑组织海马CA1区病理形态学变化;采用Hoechst 33258染色荧光显微镜观察脑组织海马CA1区神经元凋亡;采用电镜观察大鼠脑组织海马神经元超微结构;采用RT-PCR检测大鼠脑组织中β淀粉样前体蛋白(APP)、α-分泌酶、β-分泌酶,Caspase-3 mRNA的表达水平;采用免疫组化检测大鼠脑组织海马CA1区APP、Aβ1-40、细胞色素c和Caspase-3的表达水平;采用western blot检测大鼠海马组织APP蛋白表达水平;采用ELISA试剂盒检测大鼠海马组织Aβ1-40含量。 实验结果显示, DEX和Aβ协同作用能延长大鼠水迷宫第4天平均逃避潜伏期,减少平台象限游泳时间和穿过平台次数明显,人参皂苷Rg1组和AST20、40mg/kg组能增加小鼠在平台象限的游泳时间和穿过平台的次数。HE染色和Hoechst 33258染色结果显示,DEX和Aβ协同作用能导致大鼠脑组织海马CA1区神经元损伤和凋亡,AST对神经元的损伤具有一定的保护作用。电镜检查结果显示,DEX和Aβ协同作用大鼠脑组织海马神经元染色质有边集现象,胞浆内有大量的空泡形成,线粒体肿胀明显,脊消失,核糖体数量明显减少。人参皂苷Rg1和AST20、40mg/kg对大鼠脑组织海马神经元超微结构有一定改善作用,染色质边集现象较少,线粒体肿胀减轻,核糖体数目增加。RT-PCR分析显示,DEX和Aβ协同作用能增加APP695、APP751,β-分泌酶和Caspase-3 mRNA的表达,减少α-分泌酶mRNA表达。AST (20,40 mg·kg- 1 )和人参皂苷Rg1对DEX和Aβ诱导升高的APP695、APP751,β-分泌酶和Caspase-3 mRNA水平有一定的降低作用,对α-分泌酶mRNA水平有一定的升高作用。免疫组化结果显示,DEX和Aβ协同作用可增加大鼠脑组织海马CA1区APP、Aβ1-40、细胞色素c和Caspase-3表达,AST和Rg1能不同程度减少APP、Aβ1-40、细胞色素c和Caspase-3表达量。Western blot和ELISA结果显示,DEX和Aβ协同作用可增加大鼠脑组织海马CA1区APP、Aβ1-40表达,AST和Rg1能不同程度减少APP、Aβ1-40表达量。 第三部分黄芪总苷对糖皮质激素和Aβ协同诱导PC12细胞损伤的保护作用及其机制研究 本实验在体外观察DEX、Aβ和DEX+Aβ对PC12细胞的损伤作用和AST的保护作用及其机制。采用MTT法检测PC12细胞活力;采用Annexin-Ⅴ/PI双染和PI单染通过流式细胞仪检测PC12细胞凋亡情况;采用RT-PCR检测PC12细胞β淀粉样前体蛋白(APP)、α-分泌酶、β-分泌酶,Caspase-3 mRNA的表达水平;采用western blot检测PC12细胞APP蛋白表达水平。 MTT结果显示,DEX(0.1、1μmol/L)在作用24h后对PC12细胞活力没有明显的影响,而DEX(5、10μmol/L)在作用24h后能明显降低PC12细胞的细胞活力(D5, P0.05; D10, P0.01);Aβ(1、5、10μmol/L)在作用24h后对PC12细胞的活力均有一定的降低作用(P0.05),DEX+ Aβ各剂量组均能明显降低PC12的细胞活力(P0.01),人参皂苷Rg1(16μmol/L)和AST(10、20mg/L)对损伤的PC12细胞活力有一定的升高作用。流失细胞仪检测结果显示,DEX+Aβ作用24h可明显增加PC12细胞的凋亡率,人参皂苷Rg1和AST对PC12细胞的凋亡率有不同程度的降低作用。RT-PCR和western blot分析显示,DEX+Aβ能明显增加APP770,β-分泌酶和Caspase-3 mRNA的水平,降低α-分泌酶mRNA水平,增加APP蛋白表达。人参皂苷Rg1和AST(10、20mg/L)对升高的APP770,β-分泌酶和Caspase-3 mRNA水平有一定的降低作用,对α-分泌酶mRNA水平有一定的升高作用,能降低APP蛋白的表达。 结论 应激水平的糖皮质激素能降低小鼠的学习记忆功能,对小鼠脑组织皮层和海马神经元具有一定的损伤作用;糖皮质激素和Aβ协同作用能促进大鼠学习记忆功能障碍,促进对大鼠海马神经元和PC12细胞的损伤作用。其机制可能与增加APP的表达,影响与APP代谢相关酶的表达,导致Aβ的生成增多以及促进线粒体损伤、细胞色素c释放、Caspase-9和Caspase-3表达诱导神经元凋亡有关。表明糖皮质激素和Aβ协同作用在AD的发病和发展中可能起着重要的作用。 黄芪总苷对糖皮质激素、糖皮质激素协同Aβ诱导的学习记忆功能障碍、神经元和PC12细胞损伤具有一定的改善作用,其作用机制可能与抑制APP表达,减少Aβ生成,降低糖皮质激素和Aβ神经毒性作用,抑制神经元的凋亡等有关,可能在防治AD的发生和发展中具有一定的作用。
【学位授予单位】:安徽医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R285.5

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中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李维祖;黄芪总苷对糖皮质激素和β-淀粉样蛋白协同诱导神经元损伤的保护作用及其机制研究[D];安徽医科大学;2010年
2 洪盾;成骨分化中糖皮质激素信号通路的研究[D];浙江大学;2011年
3 周建;糖皮质激素对肥大细胞脱颗粒的快速抑制作用及其非基因组机制[D];第二军医大学;2006年
4 张雄飞;地塞米松部分通过Foxol转录因子抑制胰岛β细胞内PDX-1因子[D];南京医科大学;2007年
5 孟庆元;糖皮质激素对前额皮层促肾上腺皮质激素释放因子的调控[D];中国科学技术大学;2010年
6 邓琳子;阿司匹林/糖皮质激素对骨髓间充质干细胞凋亡的影响及其信号调控机制[D];中国协和医科大学;2009年
7 徐明娟;糖皮质激素抑制人卵巢癌细胞系3AO、人乳腺癌细胞系MCF-7增殖的分子机制[D];第二军医大学;2002年
8 魏翠柏;健脑安对脑缺血再灌注后高糖皮质激素促海马神经细胞凋亡作用的影响[D];北京中医药大学;2004年
9 王兆杰;股骨头缺血坏死的发病机制及与血栓前状态关系的实验研究[D];四川大学;2005年
10 徐波;糖皮质激素对ALL细胞Bim、Puma表达的影响及HA14-1诱导ALL细胞凋亡的途径[D];中国医科大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 郭明川;胡黄连甙II的分离提取及药理学研究[D];华东理工大学;2005年
2 黄春霞;氯通道阻滞剂对Aβ_(25-35)诱导PC12细胞凋亡的保护作用及其机制研究[D];第四军医大学;2008年
3 于舒;红景天苷对低糖低血清损伤PC12细胞的保护作用[D];南通大学;2008年
4 董晓丽;L-肌肽对H_2O_2诱导PC12细胞凋亡的保护作用的实验研究[D];兰州大学;2006年
5 刘叶明;原儿茶酸对鱼藤酮诱导的PC12细胞凋亡的保护作用[D];大连理工大学;2007年
6 王婧吉;补肾益智方含药脑脊液对AD细胞模型的影响[D];广州中医药大学;2009年
7 韩流;糖皮质激素对心脏直视手术围术期肺动脉血中性粒细胞和肺呼吸功能的影响[D];南京医科大学;2004年
8 傅荧;哮喘大鼠CD4~+CD25~+调节性T细胞的变化及地塞米松的干预作用[D];广西医科大学;2005年
9 龙飞;糖皮质激素对巨噬细胞快速非基因组作用的研究[D];青岛大学;2005年
10 彭艳;更年Ⅰ号对糖皮质激素所致实验性骨质疏松大鼠的防治作用[D];黑龙江中医药大学;2005年
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