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《安徽医科大学》 2010年
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玉屏风多糖提取和成分分析及对实验性肝纤维化预防作用及机制研究

王佳佳  
【摘要】: 玉屏风散由黄芪[Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao]、白术(炒)[Rhizoma Atractylodis Macrocephalae (baked)]、防风[Saposhnikovia divaricata (Turez.) Schischk.]三味组成,为治疗表虚自汗的经典名方。现代中药研究认为,由于中药独特用药体系和多以复方形式用药的特点,中药复方真正发挥药理作用的活性物质基础,是指复方中产生某种药效活性物质的总和,因此研究中我们从玉屏风散整体出发追踪其多糖类活性成分,而非分别研究三味组成单药的活性多糖再加以配伍组合。在我们的前期研究中,对玉屏散总多糖进行了分级分离,通过活性筛选证实了玉屏风多糖(YPF-P)为玉屏风散中最具药理活性的多糖类成分,且发现YPF-P对环磷酰胺诱导的免疫力低下小鼠具有免疫调节活性,对于急性化学性及急性免疫性肝损伤均具有一定的肝脏保护作用。在此基础上,本课题组秉持药物化学研究与药理研究密切结合的研究思路,一方面从玉屏风散复方整体中优化提取YPF-P,并通过多种化学及仪器检测深入研究YPF-P的组成及结构,为阐明玉屏风散活性多糖的构效关系提供化学基础;另一方面,通过CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型,从血清学、组织学、分子生物学等水平系统观察YPF-P对大鼠肝纤维化的防治作用及其可能的发生机制,并考察YPF-P及其主成分多糖YPF-P1对体外培养的HSC-T6生长及对TGF-β1刺激后HSC-T6增殖的影响,为抗肝纤维化治疗研究和临床慢性肝病的防治提供新的药物选择。研究主要内容如下: 1.玉屏风多糖(YPF-P)的制备及多糖组成结构研究 YPF-P制备实验旨在通过正交试验设计法优选YPF-P的提取工艺条件,并建立YPF-P的含量测定方法。实验采用L9(34)正交试验设计法制备玉屏风散活性多糖,通过分光光度计以苯酚硫酸法测定多糖含量,以多糖提取量为指标优选YPF-P最佳提取工艺。结果提示,YPF-P提取的最佳条件为料液比1:15,于90°С提取3次,每次2h。实验中成功建立了YPF-P的含量测定方法,验证试验表明优选出的提取工艺稳定、合理、可行。 YPF-P组成结构研究旨在考察YPF-P的组成及其主成分多糖(YFP-P1)的化学结构特征,以期阐明复方玉屏风散的药效物质基础。实验从复方玉屏风散中经水提醇沉、脱蛋白后得到YPF-P,先后经DEAE sephadex A-25柱分离和Sephadex G-200柱进一步纯化,得到3个重均分子量均一的多糖YPF-P1、YPF-P2、YPF-P3,通过高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定多糖分子量;通过多糖完全酸水解,通过薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)两种方法进行YPF-P1单糖组成研究,并进行高碘酸氧化、红外光谱(IR)、1H-NMR及13C-NMR谱检测以掌握YFP-P1的基本结构特征。实验结果表明,YPF-P的组成多糖分子量分别为YPF-P1(488,500Da)、YPF-P2(232,500Da)、YPF-P3(1,863,000Da);YPF-P1为一高度分支化的杂多糖,由葡萄糖(Glc),半乳糖(Gal),果糖(Fru)及阿拉伯糖(Ara)以摩尔比3: 2.5: 1.75: 1组成,此外还含有微量的鼠李糖(Rha),半量的Gal以半乳糖醛酸(GalA)形式存在,主链部分由1, 6-α-D-吡喃葡萄糖苷、1, 6-β-D-吡喃半乳糖以6: 5构成,侧链部分由1, 3-β-D-呋喃果糖苷,甲基-β-呋喃阿拉伯糖苷和/或甲基-α-鼠李糖苷构成,与葡萄糖残基O-6相连。 2.玉屏风多糖(YPF-P)对实验性肝纤维化的预防作用及机制研究 实验旨在考察YPF-P对大鼠肝纤维化的药效作用及部分机制,并研究对HSC-T6细胞株增殖的影响。体内实验中,通过给予SD大鼠皮下注射CCl4花生油溶液12周,每周2次,成功建立肝纤维化模型;大鼠随机分为正常组,模型组,YPF-P (30, 60, 120 mg·kg?1)三剂量组,黄芪多糖(AP)60 mg·kg?1组,秋水仙碱阳性药对照组;采用Masson染色观察肝脏病理组织学改变,电镜观察肝细胞、HSC形态,放免法测定血清HA、LN、CIV、PCIII水平,血清TGF-β1水平及肝组织TGF-β1蛋白含量分别由ELISA和免疫组化法测定,肝组织α-SMA蛋白与mRNA水平经免疫组化法和RT-PCR法测定,TIMP-1、MMP-13、Procollagen ?、CollagenШmRNA均经RT-PCR法测定。结果显示,YPF-P能够显著减轻肝纤维化病变程度,抑制HSC向MFb的转化进程,显著降低肝纤维化时升高的血清HA、LN、CIV、PCIII、TGF-β1水平,减少肝组织TGF-β1蛋白及α-SMA蛋白、基因的表达,显著抑制TIMP-1、Procollagen ?、Collagen III mRNA表达,促进TIMP-1/MMP-13比例恢复,除YPF-P 120 mg·kg?1组增加MMP-13 mRNA表达(p0.05)外,其它YPF-P组对其表达无显著性差异;与AP相比,YPF-P在HA、TGF-β1、TIMP-1 mRNA、TIMP-1/MMP-13 ratio、procollagen ? mRNA (p0.05),PCШ和collagenⅢmRNA表达(p0.01)上都具有更佳的疗效,但在血清LN, CIV和MMP-13 mRNA表达上无显著性差异。结果提示YPF-P能够有效预防CCl4诱导的大鼠肝纤维化的形成,延缓纤维化进程,作用呈剂量依赖趋势,YPF-P比AP更具有药效优势,其机制与抑制TGF-β1表达、恢复TIMP-1/MMP-13酶系的平衡,抑制基质胶原的生成促进降解有关。 体外实验中,通过绘制细胞生长曲线观察YPF-P、YPF-P1对HSC-T6生长的影响,采用MTT法考察YPF-P、YPF-P1对TGF-β1诱导的HSC-T6增殖的影响。结果表明,YPF-P(50、100、200mg/L)、YPF-P1(100、200mg/L)给药均可抑制正常HSC-T6的增殖;YPF-P 50-200mg/L(p0.01),YPF-P1 12.5-25 mg/L(p0.05)、50-200 mg/L(p0.01)均可抑制TGF-β1诱导的HSC-T6增殖; YPF-P1增殖抑制率多高于同等剂量的YPF-P(100 mg/L除外),24h内YPF-P增殖抑制率高于YPF-P1。结果提示,YPF-P、YPF-P1均具有对TGF-β1诱导的HSC-T6增殖抑制作用,YPF-P发挥作用较快,YPF-P1在抑制强度上更具优势。
【学位授予单位】:安徽医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R284.1;R285

【参考文献】
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