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《蚌埠医学院》 2011年
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三羟异黄酮对丙烯酰胺诱导大鼠小脑颗粒神经元凋亡的保护作用

周礼华  
【摘要】:目的: 体外建立丙烯酰胺(acrylamide,ACR)诱导大鼠小脑颗粒神经元(cerebellargranule neurons,CGNs)凋亡模型,研究三羟异黄酮(Genistein,GEN)对ACR诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡是否具有保护作用,并探讨其可能的机制。 方法: 取新生5-7d SD大鼠小脑皮质细胞进行分离和原代培养,采用神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞荧光技术鉴定神经元,将培养8d的神经元随机分组:①正常对照组;②ACR染毒组:以ACR160μmol/L、640μmol/L、3.2mmol/L、16mmol/L、160mmo/L五个剂量对CGNs进行染毒24h,根据不同剂量对细胞的抑制率,计算出其半数抑制浓度(IC50),以IC50染毒24h建立CGNs凋亡模型;③GEN预处理组:将浓度分别为10、25、50、100μmol/L的GEN预先处理细胞12h后再给ACR半数抑制浓度染毒24h,观察GEN不同浓度对神经元的影响。采用噻唑蓝(MTT)法检测ACR染毒及GEN拮抗对神经元细胞活性的影响;倒置相差显微镜及Hoechst33342染色分别观察不同处理条件下细胞及其核形态学变化;原位细胞凋亡检测法(TUNEL)观察神经元凋亡指数;半定量RT-PCR观察凋亡基因Bax、Bcl-2mRNA水平的表达。 结果: 1.经NSE鉴定,培养8d的大鼠小脑颗粒神经元细胞纯度在90%左右,完全满足实验要求。 2.MTT显示,丙烯酰胺对小脑颗粒神经元的损伤具有剂量和时间依赖性,随着剂量增加和作用时间延长,对神经元的抑制率也明显增加,根据不同剂量的抑制率计算出丙烯酰胺半数抑制浓度为10mmol/L;三羟异黄酮预处理时间和预处理浓度对神经元有不同的影响,其中,浓度为10μmol/L及25μmol/L的三羟异黄酮预处理12h可以提高神经元细胞存活率,部分逆转丙烯酰胺造成的神经元损伤。 3.细胞形态学改变、Hochest33342染色及TUNEL检测进一步验证,三羟异黄酮10μmol/L及25μmol/L预处理12h能够有效抑制丙烯酰胺诱导的细胞核固缩、核碎裂现象,降低细胞凋亡指数。 4.半定量RT-PCR结果显示,丙烯酰胺染毒后神经元细胞Bax mRNA高表达,Bcl-2mRNA弱表达,Bcl-2/Bax比值下降;10μmol/L及25μmol/L的三羟异黄酮预处理后其Bax mRNA表达有所减弱,Bcl-2mRNA表达明显增强,Bcl-2/Bax比值增加(P<0.05)。 结论: 1.适当的丙烯酰胺刺激可以在体外诱导大鼠小脑颗粒神经元发生凋亡,凋亡的产生可能与Bcl-2mRNA水平降低、Bax mRNA水平升高、Bcl-2/Bax比值下降有关。 2.三羟异黄酮对丙烯酰胺诱导小脑颗粒神经元凋亡的保护作用与其浓度有关,10μmol/L及25μmol/L组具有保护作用而50μmol/L及100μmol/L组对细胞凋亡没有保护作用。 3.三羟异黄酮对小脑颗粒神经元的保护作用与其下调Bax mRNA表达,上调Bcl-2mRNA表达、升高Bcl-2/Bax比值有关。
【学位授予单位】:蚌埠医学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R741

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【参考文献】
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