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运用转基因模型探讨骨形态发生蛋白4对骨髓造血干细胞的调控功能

徐正阳  
【摘要】:目的:1.观察生理状态下骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)的过表达对造血的影响。2.5-氟尿嘧啶诱导的骨髓抑制或应激造血条件下BMP4对造血干/祖细胞的周期、凋亡的调控以及相关机制的初步探讨。3.研究BMP4蛋白的过表达对Lineage~-c-kit~+Sca-1~+造血干细胞移植后的归巢效率和造血重建能力的影响。方法:1.BMP4过表达的C57BL/6品系转基因小鼠的构建和繁育。2.血常规仪器检测转基因小鼠的外周血各参数,通过流式细胞仪和特异性抗体标记各谱系造血祖细胞观察骨髓中各血系细胞的比例。3.荧光定量PCR检测骨髓基质中的造血调控因子Csf2、Csf3、CXCL12、SCF、ANG-1、Hif-1α的mRNA表达情况。4.Western-blot法检测骨髓基质中整合素α4蛋白的表达水平。5.5-FU以150mg/kg的剂量诱导骨髓抑制模型,提取骨髓有核细胞。6.动态观察骨髓抑制后的外周血细胞数和骨髓有核细胞数,7.通过c-kit/Sca-1荧光抗体双标HSPC,分别用Annexin V/PI和Ki-67/DAPI双染法观察其凋亡和细胞周期的变化。8.流式分选技术分选出造血干细胞,通过静脉注射移植入接受致死性剂量辐照的小鼠体内,16小时后观察经过CFSE示踪的造血干细胞的归巢效率。通过观察组间小鼠的生存期,判断所移植造血干细胞的重建能力。结果:1.相对于野生型组,生理状态下转基因小鼠外周血粒细胞数明显增高(P0.01)。2.转基因组骨髓基质中Csf3和整合素α4的mRNA和蛋白表达水平明显上调(P0.05)。3.5-FU骨髓抑制后外周血细胞数和骨髓有核细胞数在第4天达到最低点。4.生理状态下,野生型组和转基因组造血干/祖细胞周期和凋亡率无明显差异。骨髓抑制第4天,转基因组骨髓中造血干/祖细胞的G_0期比例明显降低(P0.01),凋亡率明显上升(P0.05)。5.转基因组骨髓基质中维持造血干/祖细胞静息的低氧诱导因子HIF-1α和趋化因子CXCL12明显下调(P0.01)。6.致死性辐照后,转基因组造血干细胞的移植效率和移植后小鼠生存期均明显低于野生型组(P0.01)。结论:1.生理状态下,BMP4的过表达可以促进粒系增生。同时可能是通过Csf3发挥此功能。2.骨髓抑制或造血应激条件下,BMP4的过表达降低了CXCL12和Hif-1α的mRNA表达水平,促进造血干细胞进入细胞周期,同时增加造血干细胞的凋亡率。3.造血微环境中BMP4过表达削弱了HSC的归巢效率和长期重建能力。


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