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《安徽师范大学》 2017年
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粘质沙雷氏菌ESE-2014全基因组测序与进化分析

王莹  
【摘要】:沙雷氏菌在环境中普遍存在,在水和土壤、以及植物、昆虫、人类和其他动物都有发现。沙雷氏菌属属于肠杆菌科,而粘质沙雷氏菌是沙雷氏属常见的物种。在第一版伯杰氏细菌鉴定手册中,沙雷氏属有23个种,到第五版中则只包含5个种,在1974年第八版的伯杰氏手册中合并为一个种,即粘质沙雷氏菌。随着分子生物学的发展,第九版的伯杰氏手册中则含有11个种,从2004年以后,再加上新分离鉴定的种,现在沙雷氏属总共有18个。目前,鉴定新种主要是通过生物学特征和细菌16S rRNA来确定,但是从系统发育分析来看,利用单基因16S rRNA来作为分类的标准不足之处,因为其携带系统发育信息位点较少。本研究对粘质沙雷氏菌ESE-2014进行全基因组测序,联合NCBI已释放的沙雷氏菌基因组序列,从几个方面进行比较基因组学探讨。本研究对粘质沙雷氏菌ESE-2014进行全基因组测序。首先进行DNA文库的构建,再对数据进行拼接组装,得到最佳组装结果为基因大小5019494bp;Scaffolds为19条,成功地将N50延长到3111409bp,N的个数仅为4(未知碱基),得到粘质沙雷氏菌的基因组草图。通过一代测序对Scaffolds之间的gap进行修补,最终获得全基因组序列,ESE-2014全基因组长度为5017639 bp,GC含量为59.73%,再利用相关分析软件对ESE-2014基因组进行分析。磷脂酶是A1是水解磷脂的重要酶类,含有磷脂酶A1的微生物主要包括耶和森菌、微白黄链霉菌、曲霉菌、假单胞杆菌和沙雷氏菌等,本研究分析了ESE-2014的磷脂酶基因(plaA)及其辅助基因(plaS),并探讨了沙雷氏属之间的系统发育关系,得到分析结果的如下:1.ESE-2014基因组中RNA的分析粘质沙雷氏菌ESE-2014全基因组中含有88个tRNA,其中携带缬氨酸的tRNA-Val数量最多,拷贝数目为9次;其次是携带亮氨酸的tRNA-Leu,拷贝数目为8次;还含有一个硒半胱氨酸的tRNA;有两个不知功能的tRNA-Undet;rRNA预测结果显示有5S rRNA 7个拷贝,16S rRNA和23S rRNA操纵子各有6个拷贝。2.ESE-2014基因组中重复序列的分析ESE-2014菌株中含有较多的串联重复序列,分值在500以上的有10个,分值大于100的有22个,分值在100以下的有77个;共预测到225个插入序列,且分值较高的插入序列为IS3家族。3.ESE-2014基因组中灵菌红素基因簇分析菌株ESE-2014含有灵菌红素基因簇,且含有灵菌红素合成的基因簇14个基因,包括pig(A~N),对沙雷氏属7个种28个菌株的全基因组分析发现,含有该基因簇的菌一般为沙雷氏菌,且为两种类型,一类是如粘质沙雷氏菌B3R3、U36365和WW4,pig基因簇插入在基因cueR和copA之间;另一类是普城沙雷氏菌AS9、AS12和AS13都含有pig基因簇,cueR和copA位于pig基因簇下游;其它液化沙雷氏菌含有该基因簇1~2个基因,变形斑沙雷氏菌568和深红沙雷氏菌1122不含有该基因簇。4.沙雷氏属基因组ORFs比较分析本研究发现在粘质沙雷氏菌中ESE-2014菌株含有53个特异性的ORFs,包括一些假定蛋白和酶类,如噬菌体溶菌酶(phage lysozyme),还有一些抗终止蛋白(antitermination protein)、门户蛋白(portal protein P19)和衣壳蛋白(major capsid protein)等。在这些特异性ORFs中,ESE-2014含有10个沙雷氏属特异性ORFs;另外还有11个ORFs目前还是未知的,这可能是ESE-2014特有的ORFs。5.基于plaA、plaS和16S的系统发育分析本研究中我们选取沙雷氏属10个种来进行系统发育分析,以肠杆菌科鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)和小肠结肠炎耶尔森菌(Y.enterocolitica)作为外类群;基于三个基因(plaA、plaS和16S)序列,运用最大似然法(ML)、最大简约法(MP)和贝叶斯法(BI)分别构建沙雷氏属的系统发育树。分析结果表明普城沙雷氏菌可能是较老的共生体细菌,进化速率较慢,还保有古老共生菌的一些特征;而粘质沙雷氏菌进化速率较快,其它感染动物和植物的沙雷氏菌自由生活的共生体祖先尚未解决,因此,对沙雷氏属的系统发育进行初步探讨。6.基于沙雷氏属187个核心基因的进化分析为了对沙雷氏属Serratia ureilytica NiVa 51和S.nematodiphila DZ0503SB1的系统学分类进一步探究,本研究选取187个核心基因,包括沙雷氏属种上水平9个物种,共36个菌株,运用最大似然法(ML)和邻接法(NJ)构建沙雷氏属的系统发育树,分析结果表明:嗜线虫沙雷氏菌和粘质沙雷氏菌U36365聚为一支,支持率为100,S.ureilytica和S.marcescens RSC-1聚为一支,支持率为100,它们都和S.marcescens聚为一大支,各节点支持率均很高,树形结构非常稳定,表明菌株NiVa 51和DZ0503SB1更大可能是属于S.marcescens。从系统发育树中可以看出,产灵菌红素的菌株分为两个进化枝,分支Ⅰ是粘质沙雷氏菌不同的菌株,包括ESE-2014、U36365、B3R3、FS14和WW4;分支Ⅱ是普城沙雷氏菌AS13、AS9和AS12。本研究通过高通量测序,对粘质沙雷氏菌ESE-2014基因组进行测序,再利用一代测序对生成的Scaffolds之间缺失的部分进行修补,获得了ESE-2014全基因组序列,同时利用NCBI上已经释放的沙雷氏菌的基因组序列,对菌株S.ureilytica NiVa 51和S.nematodiphila DZ0503SB1系统学分类进行了探讨;另外,本研究还对ESE-2014的磷脂酶基因(plaA)及其辅助基因(plaS)序列进行分析,并且还通过plaA及plaS来对沙雷氏属的共生体细菌祖先和自由生活细菌祖先进行了探讨。
【学位授予单位】:安徽师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q933

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