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《厦门大学》 2017年
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超高灵敏(光谱)流式检测装置的研制及其在纳米颗粒定量表征中的应用

王硕  
【摘要】:流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是一种对悬液中的细胞或细胞大小的颗粒进行高通量定量分析或分选的技术。FCM通过对单个样品颗粒散射光及多色荧光信号的同时检测,实现细胞尺寸、内部颗粒度、蛋白含量、酶活性等物理、化学及生物性质的多参数同时测定,具有统计精确性高、数据可靠、实用性强等优点。传统流式分析仪的检测通量高达每秒数万个细胞,但难以对粒径小于500 nm或者荧光亮度小于200个荧光素分子的信号进行检测。生命科学研究的不断深入和纳米科技的飞速发展均对纳米颗粒的表征技术提出了更高的要求。基于纳米粒子固有的多分散性,需要在单颗粒水平对其多种物理和生化性状进行定量表征。然而,国际上没有一种技术能够对如此微小的纳米粒子在单颗粒水平进行多参数综合表征。如果能大幅度提升传统流式细胞仪的检测灵敏度,纳米颗粒的检测将享有流式细胞术快速、多参数、定量、天然状态悬液检测等优势。结合瑞利散射和鞘流单分子荧光检测技术,本课题组研制成功超高灵敏流式检测装置(HSFCM),采用独特的流体动力学聚焦系统在低流速下实现稳定液流聚焦。通过减小探测区体积降低背景,延长样品颗粒穿越探测区时间、提升激发光功率密度、采用单光子探测器等措施增加信号,于2014年成功实现了粒径仅为7 nm的单个纳米金颗粒和粒径为24 nm的单个二氧化硅纳米颗粒散射信号以及单个藻红蛋白荧光信号的超高灵敏检测,检测灵敏度较传统FCM提升数万倍。HSFCM的研制为人工合成纳米粒子及天然生物纳米粒子(细菌、病毒、线粒体等)的快速表征提供了强有力的分析手段,在疾病诊断、生物传感、环境分析等领域具有重要意义。本研究的重点是进一步提升仪器检测灵敏度及开发高维度信号检测模式,以拓展超高灵敏流式检测技术的应用范围。基于实验室原有的HSFCM,通过对液路系统、集光系统、信号采集及软件分析系统等的一系列改进,进一步提升仪器检测灵敏度。通过对单个量子点微弱荧光信号的定量检测,发展了量子点发光亮度均一性、量子点浓度、量子点团聚程度以及环境因素对其发光性能影响等快速表征手段。此外,为了获取更丰富的单个纳米颗粒的生化信息,我们在HSFCM基础上搭建了超高灵敏光谱流式检测装置(S-HSFCM),实现了人工合成纳米颗粒及微生物的单颗粒荧光光谱检测。本论文的主要工作包含以下几个方面:第一章为文献综述。本部分主要介绍流式细胞术的发展历程、最新研究进展及发展方向,并对本论文选题思路及研究内容进行论述。第二章为HSFCM检测装置的系统优化。通过对仪器光路、液路系统的升级,进一步提高仪器的稳定性,仪器检测灵敏度较原有仪器提升2.8倍,检测信噪比(S/N)提高~1.7倍。使用仪器对单个藻红蛋白(R-PE)分子进行表征,信噪比高达34。仪器灵敏度的提升对于纳米颗粒的多参数定量检测具有重要意义。第三章为HSFCM检测装置对量子点的表征。在量子点的生产合成及实际应用中,需要准确地了解量子点的浓度、发光性能及其均一性、生物试剂偶联后是否导致量子点聚集,以及量子点所处缓冲液氛围对其发光性能的影响等物理、化学性质。我们采用性能优化后HSFCM对量子点进行单颗粒荧光检测,建立了高效的单颗粒水平量子点表征方法,仪器对Qdot655量子点检测信噪比(SNR)高达88,可轻松实现量子点发光强度、单分散性、团聚程度、颗粒浓度等的快速表征,该表征技术的建立对于指导量子点的合成、量子点质量控制和生化应用标准化流程的建立具有重要的意义。第四章为S-HSFCM检测装置的研制。为满足生命科学前沿研究、生物医学和纳米科技对于发展高灵敏、高通量的多参数定量分析技术的迫切需求,我们利用HSFCM独特的低流速流体聚焦系统和高灵敏性,通过采用高效率集光系统、高性能的分光系统和光谱型EMCCD,成功研制超高灵敏光谱流式检测装置(S-HSFCM),实现单个纳米颗粒和细菌的荧光光谱全光谱检测。仪器采用光栅分光,在0.27nm的光谱分辨率下实现与传统流式细胞仪带通检测模式相当的检测灵敏。S-HSFCM的研制将推动单细胞、单个纳米颗粒光谱检测技术的发展,为基础生命科学研究、生物医学和纳米科技的发展提供创新的表征分析技术。第五章为聚球藻的S-HSFCM检测。聚球藻是海洋蓝细菌的重要组成部分,广泛分布于世界大洋、河流及湖泊,丰度高且多样性丰富,在全球初级生产力和碳循环中发挥着重要作用。聚球藻细胞内含有特征色素藻胆素,具有独特的荧光特性。我们采用S-HSFCM在单细胞水平对不同种类聚球藻进行高通量光谱流式检测,通过对其荧光色素组分的鉴定及含量的分析,建立聚球藻生理研究及生态多样性分析的快速表征方法。第六章为总结与展望。
【学位授予单位】:厦门大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:O657.3

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