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东方肉座菌中纤维素水解酶类转录调控因子的研究

刘富川  
【摘要】:传统的化石能源无法满足人类可持续发展的需求,寻找清洁、经济的可再生能源是当今社会需要解决的主要问题之一。天然纤维素是生物质能源的主要原料。微生物在纤维素生物质的降解过程中已经开发出一种高效和复杂的机制来分泌一组水解和氧化酶,其中特别是丝状真菌在生物质降解过程中扮演着重要角色,因此对丝状真菌产酶机理的研究和改造具有重要意义。东方肉座菌EU7-22(Trichoderma orientalisEU7-22)具有高效的产酶特性和完善的酶系,是课题组诱变获得的菌株,目前已有多篇相关研究报道,本论文在东方肉座菌中克隆得到了纤维素酶转录调控因子基因ace3和β-葡萄糖苷酶转录调控因子基因bglr,构建相应的基因突变菌株,分别对其功能进行鉴定。本论文结果如下:(1)在东方肉座菌中首次克隆并鉴定了转录调控因子ACE3的功能,成功构建ace3基因缺失菌株△ace3对其产酶特性进行研究,相比原始菌EU7-22在△ace3突变菌中滤纸酶活力、内切葡聚糖酶活力和木聚糖酶活力分别下降为EU7-22的17.8%,9.8%和6.8%,外切葡聚糖酶活和β-葡萄糖苷酶活力几乎没有,对产酶基因进行分析荧光定量PCR分析,其相应产酶基因的表达量也显著降低。并且在以微晶纤维素和羧甲基纤维素钠分别作为碳源平板上产孢子的能力显降低。(2)β-葡萄糖苷酶转录调控因子的Bg1R的功能在东方肉座菌中进行了鉴定,在bglr基因突变菌Abglr中,其酶活力提升了 39%,CBH酶活力增加了 22%,木聚糖酶活增加了 16%,发酵液分泌蛋白升高20%,而β-葡萄糖苷酶活力降低47%。在分别以葡萄糖,羧甲基纤维素钠,微晶纤维素,纤维二糖为碳源的培养基中,其菌株的生长速率和产孢子量的明显降低,说明BglR是碳阻遏代谢中限速调控因子,通过对β-葡萄糖苷酶活力的影响从而调控CCR循环。(3)选取里氏木霉cbh1基因作为强启动子以潮霉素基因作为抗性标记,成功构建ace3基因表达盒。为下一步继续提升东方肉座菌产酶能力,做出前期工作。本论文通过对东方肉座菌中转录调控因子的ACE3与BglR功能进行研究,为下一步提高该菌株纤维素酶活力构建工业化菌株做出了基础工作。


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