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《厦门大学》 2001年
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乙肝病毒表面抗原基因在花生中的转化及免疫原性研究

陈红岩  
【摘要】: 花生(Arachis hypoaea)具有较高的营养价值,是一种廉价的植物蛋白质源。花生中含有约30%的蛋白质,因此是生产口服基因工程疫苗的理想载钵之一。本研究通过乙肝病毒表面抗原(HBsAg)在花生中的遗传转化研究,初步建立了花生的转化体系,并进行了初步的小鼠实验,结果表明花生表达的外源蛋白有良好的免疫原性,初步证实了转基因花生口服疫苗的可行性,为实现利用转基因花生生产大量、廉价的蛋白质疫苗提供一些实验和理论指导。受体系统:比较“泉花一号”、“汕油”、“鄂花四号”、“7868”四个花生栽培品种的半胚、小叶、胚轴等不同外植体的发芽率和发芽数,结果表明半胚最优,其次为胚轴和小叶。四个品种中又以“鄂花四号”的半胚发芽率和发芽数最高,可达92.5%和9-10个芽。 植物表达载体的构建:将乙肝表面抗原(HBsAg)基因插入植物双元表达载体pCAMBIA1301中,采用花椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子,Tnos为终止子,以gus基因为报告基因,植物抗性基因为hvg基因。 转化系统:对农杆菌转化条件的比较发现,菌株、共培养时间、共培养条件等均对转化有较显著的影响。对3个菌株(LBA4404、AGL1、EHA105)侵亲染力比较中发现,用EHA105浸染花生的转化效率最高。另在提高细胞感受态方面,在菌液和共培养基中加入0.2 mol/L CaCl(?)共培养时间由常规的2-3d增加至5d,可有效的提高转化效率。 转化体获得:选择筛选剂及确立基础抗性时,发现花生半胚对潮霉素比卡那霉素敏感,在潮霉素浓度为20mg/L时就可以完全抑制芽的分化。转化植株的筛选时,比较了间歇加压法和持续加压法。通过间歇式加压法从46个外植体中得到5株抗性体,但均未见报告基因(gus)表达,假阳性率高达100%;经持续式加压法从85个外植体中得到3株抗性体,其中2株有gus基因表达,因此最终选择持续加压法进行筛选。从花生“鄂花四号”成熟胚120颗中,利用半胚诱导、持续加压最终获得3个转化植株,均有明显gus基因表达。 转化体外源基因槛、表达酌检测:对获得的转化植株,经PCR、peR—Sou山ern 杂交和点杂交,证实目的基因己整合到花生基因组中,ELISA检测表明花生中 表达的乙型肝炎表面抗原具有良好的活性,并初步定量计算出花生小芽中 HBSAg蛋白含量分别约为1.27 X 10;g/g、2.4X 10”g/g和1.21X10rtg/g潍。 免疫原性检测:取HBSAg &jkgf高的植株巳的叶片经诱导愈伤,高压筛选 扩繁出大量愈伤组织,分别以蛋白粗提液和部分纯化的重组蛋白,肌肉注射 初兔一次的小鼠,抗体均有明显的上升趋势,表明转基因植株中表达的重组 HBSAg具有良好的免疫原性。取同样的转化硼组织,敏饲喂己免驭懒 体下降至0.025(HBsAb ELISA皿值)的Balb/c小鼠,在第 5周出现抗体回 升,第7周抗体ODM至3.54,而饲喂未经初兔的小鼠,直至第7周仍未见 明显抗体产生。这些结果表明转基因植株经口服可以诱导回亿性抗体产生, 而目前的表臼主量尚不足以作为初兔疫苗。 本研究首次将花生半胚作为转化受体用于花生遗传转化,并表明了其相 对于常规胚轴和子叶具有一定的优势,在此基础上优化了农杆菌介导的花生 半胚的遗传转化系统,并首次实现了HBSAg基因在花生中的表达,初步证实 了转基因花生作为口服疫苗的可行性,为今后研制具实用价值的转基因花生 口服疫苗奠定了坚实的基础。
【学位授予单位】:厦门大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:Q789

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【参考文献】
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