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《厦门大学》 2001年
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几种红树植物的遗传变异和抗盐特性的分子生态学研究

周涵韬  
【摘要】: 红树林(Mangroves)是生长于热带、亚热带陆海交汇的海湾河口潮间带的盐生木本植物群落,它蕴藏着丰富的动植物、微生物基因库,是一种珍贵的生物资源。红树林在维护海岸生态平衡;防风减灾、护堤保岸;环境污染监测、净化与防治等上发挥重要的作用。目前国内外对红树植物开展了大量的生物学研究工作,成果多集中在生态学,生理学,生物化学等领域,而分子生物学领域的研究工作还处于起步阶段。本文运用RAPD分子标记技术,对不同种属红树植物的遗传变异与生态分化进行了研究;首次运用改进的mRNA差别显示技术,从抗盐能力强的泌盐红树植物—白骨壤基因组中分离克隆了抗盐相关基因。同时运用蛋白质双向电泳技术,从白骨壤叶片中分离了抗盐相关蛋白质,并初步分析了该蛋白质的生化特性。具体结果如下: 1.采用改良的CTAB抽提方法,成功地从不同种属红树植物的叶片中提取和纯化了基因组DNA。获得的DNA纯度较好(A_(260)/A_(280)。在1.6-1.8之间),得率高(平均得率约为120μgDNA/g F.W.),片段完整(片段大小约为23Kb左右)。适宜于进行PCR扩增及后续分子生物学研究。说明本文首次在前人工作基础上加以改进的CTAB法,广泛适用于富含单宁、多糖、脂类、胶质类物质等的红树植物基因组DNA的提取与纯化。 RAPD扩增反应的稳定性、重复性及扩增带型的丰富性是进行红树植物遗传多样性分析的基础。使用德国Biometra公司T3型PCR仪,规范实验操作,采用如下反应体系:10mmol/L Tris-HCl,pH8.0,50mmol/L KCl,0.01%明胶,80ng模板DNA,2mmol/L MgCl_2,0.2mmol/L dNTPs,0.2μmol/L 10核苷酸随机引物,0.5U TaqDNA聚合酶,总体积25μL。扩增程序为:94℃变性1min,36℃退火1min,72℃延伸2min,共进行40个循环,最后72℃延伸7min。获得的RAPD扩增结果稳定性高,重复性好,扩增带型丰富平均为6—7条。 2.以福建九龙江口龙海红树林自然保护区浮宫种苗园内白骨壤(Avicenniamarina)、桐花树(Aegiceras corniculatum)、无瓣海桑(Sonneratia apetala)、秋茄(Kandelia candel)、木榄(Bruguiera gymnorrhiza)、海莲(Bruguierasexangula)、尖瓣海莲(Bruguiera sexangula var.rhynchopetala)等7种红树植物为材料,运用RAPD技术对这7种红树植物进行了遗传多样性分析。从30个10核苷酸随机引物中筛选出15个有效引物。利用这15个有效引物共扩增出630条DNA带,其中多态性条带535,占总扩增条带的84.92%。利用Nei指数法得出7种红树植物间 的遗传一致度和遗传距离,并运用UPGMA统计分析法对红树植物的7个种间的亲缘关 系进行聚类分析,DNA分子分类系统图。7个种分为A、B两个大组,A组中包含H个 种,B组中包含四个种。白骨壤(马鞭草科)、桐花树(紫金牛科)、无瓣海桑(海桑科) 同属于A组。白骨壤与桐花树的遗传距离为0.58而与无瓣海桑的遗传距离为0.60, 无瓣海桑与桐花树的遗传距离达0.67。可见这三种红树植物虽然聚类在同一组,但由 于彼此之间的遗传距离较远(平均0.63),符合传统形态分类,三种红树植物属于不同 科:而同属红树科的秋茄、木榄、海莲、尖瓣海莲经分子聚类一起出现在8 组,它们 的平均遗传距离为0.35,分子分类也表明它们聚类为同一科,属于科内属种间关系。 相对于秋茄而言,木榄、海莲和尖瓣海莲这三者的亲缘关系更近,平均遗传距离为 0.28,属于属内种间关系。这和传统的分类学相吻合。由此表明RAPD分于标记技术能 较为客观地反应出红树植物的遗传多样性及其相互间的亲缘关系。 3.进一步以海南东寨港红树林自然保护区中,红树(hjzonhora anjcula ta) 红海榄(Rhjzopho。stflosa)、秋茄(K8ndelia candel)、角果木(Cerjops tag81)、木榄(BrugUje。goorrhjza)、海莲(BrugU。e。sex。ngula)、尖瓣海 莲(BrugU。e。sexa。gula var.rbopchopetala)等红树科7种红树植物为材料,通 过已筛选出的15个有效引物进行RAPD分析,获得了红树科7种红树植物的遗传分类 关系。!5个有效引物共扩增出 617 条 DNA带,其中多态性条带 415,占总扩增条带的 67.26%。利用咖 指数法得出7种红树植物间的遗传一致度和遗传距离,并运用 UPG亚A统计分析法对红树植物的7个种间的亲缘关系进行聚类分析,DNA分子分类系统 图。7个种分为A、B两个大组,平均遗传距离为0.41,遗传距离最大的为角果木和尖 瓣海莲之间0.56(<0.6),表明7种红树植物在分于水平上处于同一科。 红树、红海榄及角果木处于A组。红树、红海榄遗传距离为0.23。表明红树与红 海榄在分于水平上处于同一属。这与它们在宏观分类上属于红树属相一致。角果木与 红树的遗传距离为0.38,与红海榄的遗传距离为0.46,平均为0.42(>0.4),表明角 果木与红树、红海榄为科内属间关系,这与宏观分类结果一致。 秋茄、木榄、海莲、尖瓣海莲同处于B组,并且它们种间的遗传距离和分类关系 与在福建九龙江口采样分析结果一致,从而进一步证明了RAPD分子标记技术进行红树 植物遗传多样性研究的准确性。B组分为2个亚组。秋茄处于一个亚组,它与
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